DEVELOPMENT OF PREDICTIVE APPROACHES FOR PROTEIN ENGINEERING BY DIRECTED EVOLUTION AND APPLICATION TO THE DEVELOPMENT OF AN ANTICANCER THERAPY
DEVELOPPEMENT D'APPROCHES PREDICTIVES POUR L'INGENIERIE DES PROTEINES PAR EVOLUTION DIRIGEE ET APPLICATION AU DEVELOPPEMENT D'UNE THERAPIE ANTICANCEREUSE
Résumé
One of the possibilities considered to reduce the side effects associated to chemotherapeutic treatments was to use cytotoxic prodrugs, like cyclophosphamide (CPA), activated directly into the tumors. CPA is mainly activated with a low efficiency by human CYP2B6, so large doses of prodrug are used to induce a response. The transfection of an optimized CYP gene, possessing a high catalytic efficiency towards CPA while presenting a low immunogenicity, is a route to lower active doses. For this purpose, the canine CYP2B11, which exhibits a low Km for CPA activation, was modelled and divided into 15 structural "modules". A synthetic CYP2B11 gene was designed to permit a good expression in yeast and to swap defined modules between the human and canine forms. An original sequence – independent method, SIGNAL, was developed, which allowed the construction of 15 chimeras with defined junction points. This ordered library, halfway between random directed evolution and defined directed mutagenesis, permitted the generation of targeted diversity, which do not need a high-throughput approach for functional analysis. Resulting information highlighted critical segments for CPA metabolism, which are potentially involved in the high CYP2B11 affinity. The P450 functional optimization could be further enhanced by a random mutagenesis process, which requires, in contrast, a high throughput screening system. Its development in S.cerevisiae was initiated using a reporter gene method.
Le souhait de réduire des effets secondaires associés aux anticancéreux a mené à considérer l'utilisation de prodrogues activables au site d'action, comme la cyclophosphamide (CPA). La CPA est activée majoritairement par le CYP2B6 humain avec une faible efficacité, obligeant à l'utilisation de concentrations importantes de prodrogue. Celles-ci peuvent être réduites par transfection au niveau de la tumeur d'un gène codant pour un P450 optimisé, possédant une efficacité catalytique élevée vis-à-vis de la CPA tout en étant le moins immunogène possible. Pour ce faire, en partant de la modélisation du CYP2B6 et du CYP2B11, forme canine à bas Km pour l'activation de la CPA, un gène synthétique du CYP2B11 pour l'expression dans la levure a été dessiné et divisé en 15 "modules" structuraux. Quinze chimères à points de jonction définis entre les deux CYP2Bs ont ensuite été construites par échange de ces modules, via une méthode originale de génération de banques ordonnées de chimères, SIGNAL, indépendante de l'homologie de séquence des enzymes parentaux. SIGNAL, à mi-chemin entre les processus classiques d'évolution dirigée et de mutagenèse dirigée, nous a permis, après analyse fonctionnelle des chimères, de mieux comprendre le mécanisme de métabolisation de la CPA par les deux enzymes et d'identifier des modules structuraux jouant potentiellement un rôle important dans la haute affinité du CYP2B11. En parallèle, la mise au point d'un système de sélection à haut débit des variants les plus efficaces pour l'activation de la CPA dans la levure, basé sur le principe du gène rapporteur, a été débutée, afin de pouvoir raffiner l'optimisation du P450 par un processus de mutagenèse aléatoire.