Investigation of the mechanisms of regulations, activation, and deactivation of Guanylate Cyclase, the endogenous NO-receptor, and NO-sensors
Etude des mécanismes de la régulation, activation et désactivation de la guanylate cyclase, récepteur endogène du monoxyde d'azote, et de senseurs de NO
Résumé
The endogenous NO receptor, soluble guanylate cyclase (sGC) is the subject of this thesis. This enzyme synthesizes cGMP after NO binding. The main tool used is time-resolved picosecond-nanosecond absorption spectroscopy. We have shown that the simultaneous binding of CO and activators (YC-1, Bay 41-2272) induce a 5c heme-CO, like NO, explaining the synergistic activation. We identified all steps of the sGC-NO interaction by measuring the dynamics from picosecond to second. This dynamics of the entire protein is compared with that of the isolated beta subunit (1-190) and bacterial NO sensors. A myoglobin mutant (H93C) was used as a model for the study of heme in the 4- and 5-coordinated states. Finally, we measured the band III absorption of Mb and Hb to measure the movement of the heme iron after NO binding. We also investigated a potential inhibitor and an endogenous ligand of sGC.
Le récepteur endogène du NO, la guanylate cyclase (sGC) est l'objet de thèse. Cette enzyme synthétise le GMPc après fixation du NO. L'outil principal utilisé est la spectroscopie d'absorption résolue en temps picoseconde-nanoseconde. Nous avons montré que la fixation simultanée du CO et d'activateurs (YC-1, Bay 41-2272) induisent un hème 5c-CO, à l'instar du NO seul, expliquant l'activation synergique. Nous avons identifié toutes les étapes de l'interaction sGC-NO en mesurant la dynamique du NO de la picoseconde à la seconde. Cette dynamique dans la protéine entière est comparée à celle de la sous-unité beta (1-190) isolée et celle de senseurs de NO bactériens. Un mutant de la myoglobine (H93C) à été utilisé comme modèle pour l'étude de l'hème dans les états 4- et 5-coordonnés. Enfin, nous avons mesuré la variation d'absorption dans la bande III de la Mb et Hb pour mesurer le mouvement du Fer de l'hème aprés fixation du NO. Nous avons cherché un inhibiteur potentiel et un ligand endogène de la sGC.
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