Involvement of nerve growth factor (NGF) and acid-sensing ion channels (ASIC) in colonic hypersensitivity induced by butyrate in the rat
Étude de l'implication du nerve growth factor (NGF) et des acid-sensing ion channels (ASIC) dans l'hyper-sensibilité colique induite par le butyrate chez le rat
Résumé
Functional gastrointestinal disorders are characterized by abdominal pain and discomfort that affect the quality of life of many patients worldwide. Irritable bowel syndrome (IBS), the most common functional gastrointestinal disorder, is characterized by intractable visceral hypersensitivity in absence of any structural or biochemical abnormality of the colon. The lack of understanding regarding its precise pathophysiology makes the identification of new drug targets difficult. This issue is a public healthcare stake since functional gastrointestinal disorders, and especially IBS, affect 20% of the western population. Animal models are an useful way of testing etiological hypotheses on the mechanisms of visceral pain provided by clinical studies. We thus used an animal model of IBS, the butyrate model, which has been developped in the lab with respect to clinical data reporting a higher colonic concentration of butyrate, a short chain fatty acid, in patients with IBS. This model consists of six intracolonic enemas of butyrate 200mM, performed in four days, which induce a colonic hypersensitivity (CHS) in the rat starting from the last enema. Butyrate-induced CHS can be assessed using the colorectal distention (CRD) test. This CHS is persistent and is not associated with mucosal alterations what is relevant for the clinical caracteristics of IBS. Face validity, predicitive validity and construct validity of the butyrate model have been explored and we now aimed at decyphering the peripheral and central mechanisms by which butyrate induces CHS. Preliminary results had shown that a neonatal treatment with capsaicin, which destroys nociceptive peptidergic C-fibres, prevented the development of butyrate-induced CHS in adult rats. Colonic type C afferences thus convey the nociceptive message induced by butyrate. The main goal of our work was to determine what mechanisms underly sensitization of these afferences by butyrate. We hypothesized that nerve growth factor (NGF), a neurotrophin involved in nociception and in neurogenic inflammation of enteric nerves in IBS, could contribute to sensitization of the colon. Involvement of NGF in CHS We have shown that repeated administrations of anti-NGF antibodies (i.p. route) prevented the butyrate-induced CHS, assessed by the CRD test. Moreover, we have shown with immuno-histo-chemistry (IHC) that NGF was expressed in the colon of rats treated with butyrate but its expression was not increased. On the other hand, NGF was overexpressed in dorsal root ganglia (DRG) innervating the colon. These results suggested that NGF is involved in butyrate-induced CHS and that it could exert its effect mainly in the peripheral nervous system (DRG). The NGF is indeed involved in the development of hyperalgia by inducing the expression of molecules playing a key role in nociception such as ion channels. We have focused on acid-sensing ion channels (ASIC) and transient receptor potential vannilloid1 (TRPV1) according to numerous papers reporting their involvement in visceral pain and their modulation by the NGF. Involvement of ASIC in CHS We have shown that administration of amiloride (ASIC antagonist, i.v. route) but not of capsazepine (TRPV1 antagonist, i.p. route) prevented butyrate-induced CHS, assessed with the CRD test. Butyrate-induced CHS thus involves an ASIC-dependent TRPV1-independent mechanism. Furthermore, we have shown with semi-quantitative RT-PCR that the expression level of ASIC1a and ASIC1b mRNA was increased in DRG of rats treated with butyrate. This increase was correlated to an increase in the expression of the ASIC1A protein in DRG, quantified with IHC. By determinating the proportion of ASIC1A immuno-reactive (IR) neurons, we have shown that this overexpression was limited to small-diameter neurons. These results indicated that the channel ASIC1A was involved in butyrate-induced CHS. We then wanted to know if, according to the bibliography, ASIC1A overexpression could be consecutive to that of NGF. Modulation of ASIC1A expression by NGF in CHS We first have shown with confocal microscopy that NGF and its high affinity receptor (trkA) were colocalized with ASIC1A in sensory neurons and especially in those expressing calcitonin gene-related peptide. We then have shown using IHC and Western blot that ASIC1A overexpression in DRG was prevented by blocking NGF with repeated administrations of anti-NGF (i.p. route). These results suggested that ASIC1A overexpression was NGF-dependent. We concluded that NGF and ASIC1A intervene in DRG (and likely in nociceptive sensory neurons) where they contribute to sensitization phenomena leading to butyrate-induced CHS. However, we did not report any variation in the expression of NGF and ASIC1A in the colon. This result suggested that these molecules are involved rather in the presynaptic element of the first central nociceptive synapse where they could enhance the synaptic transmission than in the free synaptic endings of the colonic wall. We thus have hypothesized that butyrate-induced CHS was associated to central sensitization of the spinal cord. Central sensitization in CHS We have used the Fos method, a marker for neuronal activity, in order to evaluate the spinal excitability in rats treated with butyrate. The study of spinal expression of Fos protein in rats challenged with repeated noxious CRD showed that butyrate rats presented an increase in the density of Fos-IR neurons in the superficial layers of the thoracic dorsal spinal cord in comparison with control rats. Butyrate-induced CHS was characterised by a specific recruitment of the thoracic spinal segments T10-T11-T12 in which we found a neuronal hyperresponsivness to CRD. Moreover, in absence of colonic stimulation, butyrate-treated rats presented a basal hyperactivity in these segments. As the spinal ASIC1A channel contributes to ion currents evoked by painful stimulations, we wanted to know if this spinal hyperactivity could be consecutive to an increased synaptic transmission involving ASIC1A. We have shown that PcTx1 administration (ASIC1A antagonist, i.t. route) prevented the butyrate-induced CHS, assessed with the CRD test. This result suggested that ASIC1A channels contribute to central mechanisms of CHS in the butyrate model. We have also shown with RT-PCR and Western blot that ASIC1A was overexpressed in the spinal cord of rats treated with butyrate. Moreover, it was expressed in spinal neurons activated by CRD where it was colocalized with Fos. ASIC1A could thus participate to the transmission of the nociceptive visceral message in the dorsal spinal cord. The expression level of ASIC2a and ASIC2b mRNA was also found increased in the spinal cord using RT-PCR what suggested that the spinal hyperexcitability in the butyrate model could result from an increase in ion conductances generated by the activation of heteromeric channels type ASIC1/ASIC2. Similarly to the peripheral mechanisms of butyrate-induced CHS, the overexpression of ASIC1A could be NGF-dependent. Our results have indeed shown that NGF was expressed in the spinal cord and that systemic administration of anti-NGF antibodies prevented the overexpression of ASIC1A mRNA and protein in butyrate rats. To conclude, this work suggest that NGF and ASIC1A play a key role in the development of visceral pain by contributing to peripheral and central sensitization. Improving the understanding of NGF-ASIC1A interplay could lead to new lines of research in the treatment of visceral pain of unknown etiology such as CHS in IBS, based on strategies aiming the potentiating effect of NGF on ASIC.
Les douleurs viscérales sont des douleurs diffuses et irradiantes dont le traitement est souvent problématique faute d'étiologie bien identifiée. En particulier, les douleurs abdominales observées dans les troubles fonctionnels digestifs (TFI) s'expriment en l'absence d'atteinte organique ce qui rend difficile la compréhension des mécanismes physio-pathologiques de ces troubles. Cette problématique est un enjeu de santé publique puisque les TFI, et en premier lieu le syndrome de l'intestin irritable (SII), concerneraient 20% de la population occidentale. Les études cliniques fournissent des pistes de recherche sur l'origine des troubles dans les TFI mais sont souvent insuffisantes pour décortiquer leurs mécanismes physio-pathologiques. Les modèles animaux apparaissent comme une voie alternative permettant de tester des hypothèses diverses sur l'origine des douleurs viscérales. Nous avons ainsi utilisé un modèle animal de SII développé au laboratoire, le modèle butyrate, qui se base sur des données cliniques rapportant un excès de butyrate, un acide gras à chaîne courte, dans le côlon des patients atteints de SII. Ce modèle consiste en 6 instillations intra-coliques de butyrate 200mM, réalisées sur une durée de 4 jours, qui induisent une hyper-sensibilité colique (HSC) chez le rat dès la fin des instillations. L'HSC induite par le butyrate est évaluable par le test de distension colo-rectale (DCR). Elle est persistante et ne s'accompagne pas de lésion de la muqueuse colique ce qui est en accord avec les caractéristiques cliniques du SII. Après avoir établi la pertinence du modèle butyrate pour l'étude du SII, l'équipe s'est attaché à l'étude des mécanismes par lesquels le butyrate induit une HSC. Un traitement néo-natal des rats par la capsaïcine, qui permet de détruire les fibres nociceptives de type C, empêche le développement de l'HSC induite par le butyrate chez ces rats devenus adultes. Les afférences coliques de type C transmettent donc le message douloureux viscéral induit par le butyrate. L'objectif premier de ce travail de thèse a été de déterminer par quel mécanisme le butyrate sensibilise ces afférences. Nous avons émis l'hypothèse que le nerve growth factor (NGF), une neurotrophine impliquée dans la nociception et dans les processus d'inflammation neurogène des nerfs entériques dans le SII, pourrait contribuer à la sensibilisation colique. Implication du NGF dans l'HSC Nous avons montré que l'administration répétée d'anticorps anti-NGF (voie i.p.) prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée lors du test de DCR. De plus, nous avons montré par immuno-histo-chimie (IHC) que le NGF est exprimé dans le côlon des rats traités avec du butyrate mais son expression n'y est pas augmentée. En revanche, le NGF est sur-exprimé dans les ganglions rachidiens dorsaux (GRD) innervant le côlon. Ces résultats indiquent que le NGF est impliqué dans l'HSC induite par le butyrate et que son action pourrait s'exercer principalement au niveau du système nerveux périphérique (GRD). En effet, le NGF est impliqué dans le développement des phénomènes d'hyperalgie en induisant l'expression de molécules jouant un rôle clé dans la nociception comme les canaux ioniques. Notre attention s'est portée sur les canaux ioniques sensibles à l'acide (ASIC) et le transient receptor potential vannilloid1 (TRPV1) car de nombreuses études ont montré l'implication de ces canaux dans les douleurs viscérales et leur modulation par le NGF. Implication des canaux ASIC dans l'HSC Nous avons montré que l'administration d'amiloride (antagoniste des canaux ASIC, voie i.v.) mais pas celle de capsazepine (antagoniste du TRPV1, voie i.p.) prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée lors du test de DCR. L'HSC induite par le butyrate implique donc un mécanisme dépendant des ASIC mais pas de TRPV1. De plus, nous avons montré par RT-PCR semi-quantitative que le niveau d'expression des ARNm des gènes codant les sous-unités ASIC1A et ASIC1B est augmentée dans les GRD des rats butyrate. L'augmentation du niveau d'expression des ARNm a été corrélée à une augmentation de l'expression de la protéine ASIC1A dans les GRD, quantifiée par IHC. En déterminant la proportion de neurones immuno-réactifs (IR) à la protéine ASIC1A, nous avons montré que sa sur-expression est restreinte aux neurones de petit diamètre. Ces résultats montrent que le canal ASIC1A est impliqué dans l'HSC induite par le butyrate. Nous avons ensuite voulu savoir si, en accord avec la bibliographie, la sur-expression de ASIC1A pouvait être la conséquence de celle du NGF. Modulation de l'expression de ASIC1A par le NGF dans l'HSC Nous avons tout d'abord montré par microscopie confocale que le NGF et son récepteur de haute affinité (trkA) sont colocalisés avec ASIC1A dans les neurones sensoriels et en particulier dans ceux exprimant le calcitonin gene-related peptide. Nous avons ensuite montré par IHC et par Western blot que la sur-expression de ASIC1A dans les GRD est prévenue par le blocage du NGF grâce à l'administration répétée d'anticorps anti-NGF (voie i.p.). Ces résultats indiquent que la sur-expression de ASIC1A dans l'HSC induite par le butyrate est dépendante du NGF. Nous pouvons conclure que le NGF et le canal ASIC1A interviennent dans les GRD (et probablement dans les neurones sensoriels de type nociceptif) où ils participent aux phénomènes de sensibilisation concourant au développement de l'HSC induite par le butyrate. Nous ne rapportons pas de variation d'expression du NGF ou de ASIC1A au niveau colique. Ce résultat suggère que la mise en jeu de ces molécules ne se fait pas au niveau des terminaisons libres coliques mais plutôt dans l'élément pré-synaptique de la première synapse nociceptive centrale où elles pourraient amplifier l'activité synaptique médullaire. Nous avons ainsi émis l'hypothèse que l'HSC induite par le butyrate est associée à une sensibilisation centrale de la moëlle épinière (MEp). Sensibilisation centrale dans l'HSC Nous avons utilisé la méthodologie Fos, un marqueur de l'activité neuronale, afin d'évaluer l'état d'excitation de la MEp chez les rats butyrate. L'étude de l'expression spinale de la protéine Fos chez les rats soumis à une DCR nocive répétée a montré que les rats traités avec du butyrate présentent une densité de neurones Fos-IR augmentée par rapport aux rats contrôles dans les couches superficielles de la corne dorsale de la MEp. L'HSC induite par le butyrate s'accompagne spécifiquement du recrutement des segments thoraciques T10-T11-T12 de la MEp dans lesquels nous avons observé une une hyper-réactivité neuronale en réponse à la DCR. De plus, en l'absence de stimulation colique, les rats butyrate présentent hyper-activité basale dans les segments T10-T11-T12. Comme le canal ASIC1A spinal participe aux courants provoqués par un stimulus douloureux, nous avons ensuite voulu savoir si cette hyper-activité de la MEp pouvait être la conséquence d'une transmission synaptique accrue impliquant ASIC1A. Nous avons montré que l'administration de PcTx1 (antagoniste des canaux ASIC1A, voie i.t.) prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée lors du test de DCR. Ce résultat indique que les canaux ASIC1A participent aux mécanismes centraux de l'HSC dans le modèle butyrate. Nous avons également montré par RT-PCR et Western blot que le canal ASIC1A est sur-exprimé dans la MEp des rats butyrate. De plus, il est exprimé dans les neurones spinaux activés par la DCR où il est co-localisé avec Fos. ASIC1A pourrait donc participer à la transmission du message nociceptif viscéral dans la corne dorsale de la MEp. L'expression des ARNm codant les sous-unités ASIC2A et ASIC2B a également été trouvée augmentée dans la MEp par RT-PCR ce qui suggère que l'hyper-excitabilité spinale observée dans le modèle butyrate pourrait résulter d'une augmentation des conductances ioniques générées par l'activation des canaux hétéromériques de type ASIC1/ASIC2. Tout comme à la périphérie, la sur-expression de ASIC1A pourrait être sous dépendance du NGF. Nos résultats montrent en effet que le NGF est exprimé dans la MEp et que l'administration systémique répétée d'anticorps anti-NGF prévient la sur-expression des ARNm et de la protéine ASIC1A dans la MEp des rats traités avec du butyrate. En conclusion, ce travail de thèse suggère que le NGF et le canal ASIC1A jouent un rôle critique dans le développement de douleurs viscérales en contribuant à la fois aux phénomènes de sensibilisations périphérique et centrale. La meilleure compréhension des mécanismes d'interaction ASIC-NGF dans l'HSC pourrait donc ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement des douleurs viscérales d'étiologie inconnue comme le SII en se basant sur des stratégies visant à diminuer l'effet potentialisateur du NGF sur les ASIC.