Fluorescence spectroscopie : application to characterize the interaction between biological macromolecules and the helicase enzymatic activity studies
Spectroscopie de fluorescence : application pour la caractérisation d'interactions entre macromolécules d'intérêt biologiques et l'étude enzymologique de l'activité hélicase
Résumé
This thesis presents the applications of fluorescence detection approaches in understanding the fundamental principles of the light activation of biomolecules, bioassemblies, and their catalytic mechanisms. In this context, three frequently used fluorescent methods have been discussed. The first technique, the fluorescence cross-correlation spectroscopy, based on measurements in micro-volumes with weak molecular concentration, has been essentially applied to monitor the crosscorrelation of the fluorescence fluctuations of the two complementary DNA strands. In particular, the helicase activity of E.Coli RecQ enzyme and the strand annealing activity of human RecQ5 helicase have been monitored. Results proved that the FCCS approach is particularly well-suited for monitoring the RecQ helicase enzymatic activity. The second technique, the fluorescence steady-state anisotropy measurements, has been adopted to analyse impact of the two main Raltegravir resistance pathways (N155H and G140S/Q148H) on HIV viral replication and the catalytic properties of recombinant integrase (INs). Results demonstrated the Q148H mutation is responsible for predominant resistance to Raltegravir whereas the G140S mutation increases viral fitness in the context of double mutant G140S/Q148H. The third technique, the time-resolved photoluminescence decay measurement, has been conducted to characterise the fluorescent properties of MPA capped CdTe quantum dots (QDs). Results confirmed the advantages of QDs and their promising applications in fluorescent labelling. In conclusion, this thesis encompasses the fundamentals and various applications involving the integration of light, photonics and biology into biophotonics.
Ce mémoire présente la mise en place des techniques de fluorescence en milieu biologique pour mieux comprendre le principe des interactions entre macromolécules biologiques ainsi que leurs mécanismes catalytiques. Dans ce contexte, nous avons appliqué trois méthodes d'analyse de la fluorescence. Une première technique d'analyse dynamique, la spectroscopie de cross-corrélation de fluorescence, basée sur des mesures en micro-volume et sur une faible concentration moléculaire, a essentiellement été appliquée à étudier l'activité hélicase en mesurant la corrélation croisée des fluctuations de fluorescence entre deux molécules d'ADN complémentaires. En particulier, l'activité d'hélicase de la protéine E.Coli RecQ et l'activité d'annealing pour la protéine RecQ5 humaine ont été étudiées. Les performances de la technique FCCS pour appréhender l'étude des activités enzymatiques de la famille des hélicases RecQ ont été validées par nos résultats. Une deuxième technique d'analyse dynamique qui nous permet de mesurer l'anisotropie de fluorescence statique a été appliquée pour comprendre l'effet de deux voies de résistances au Raltégravir (N155H et G140S/Q148H) sur la réplication virale du virus VIH-1 et sur les propriétés enzymatiques de l'intégrase du VIH (INs). Les applications de cette technique nous ont permis de démontrer la mutation Q148H joue un rôle prépondérant pour la résistance au Raltegravir, tandis que la mutation G140S augmente la fitness virale dans le contexte de la double mutation G140S/Q148H. Une troisième technique d'analyse dynamique, le déclin de la photo luminosité résolue en temps de la fluorescence, a été appliquée à caractériser les propriétés de fluorescence de nanocristaux de CdTe couronnés par MPA. Cette approche a confirmé les avantages des nanocristaux et leurs applications pour le marquage de fluorescence. En conclusion, ce mémoire inclus les principes et les applications variées des techniques de fluorescence qui sont engagées à intégrer la domaine différente (lumière, photoniques et biologie) dans la même domaine biophotonique.