Etude de la cryoconservation d'apex en vue d'une conservation à long terme de collections de ressources génétiques végétales : compréhension des phénomènes mis en jeu et évaluation de la qualité du matériel régénéré sur le modèle pelargonium

Anthony Gallard (1)

1 GENHORT - Génétique et Horticulture

The conservation of the plant genetic resources is a major challenge, biodiversity being a key for the future generation well-being. Being a part of this preservation topic, the main objective of this PhD thesis was to set up a cryopreservation procedure on Pelargonium, a vegetatively propagated ornamental plant. Apex cryopreservation by "droplet-vitrification" was optimised on P. x peltatum ‘Balcon Lilas'. Apices of 28 accessions were successfully cryopreserved with a 40 %average regrowth. The establishment of a cryobank is now possible. However the optimisation of post-cryopreservation survival needed a better knowledge of cryoprotector effects on cells. Studies by microscopy including the RTM (Real Time Microscopy) and the CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) were realised. They allowed to bring to light, the vitrification solution (PVS2) induced an important and fast shrinkage of cells by acting on cell walls, that the loading solution (LS), besides its role as osmoticum, eased the changes due to PVS2. Studies on in vitro apex culture showed that the regeneration was mostly direct. This result can partially explain that regeneration apices gave true-to-type for both cryopreserved and non cryopreserved plants, except for some chimeral cultivars. Finally, using ELISA tests, we demonstrated that apex cryopreservation could also result in PFBV and PLPV viruses eradication. However immunolocalisations put in evidence cryopreservation allowed only a partial elimination of the two viruses in the apices. As shown by immunolocalisation process the increase of this knowledge should allow a wider use of cryopreservation, giving a complementary possibility so participating in a better management of the conservation plant genetic resources conservation.

La conservation des ressources génétiques végétales est un défi majeur, le maintien de la biodiversité étant capital pour répondre aux besoins des générations futures. Ce travail de thèse, s'inscrivant dans cette démarche de conservation, a été réalisé sur Pelargonium, plante ornementale multipliée végétativement. Un procédé de cryoconservation d'apex par « dropletvitrification » a été mis en place avec succès sur P. x peltatum ‘Balcon Lilas'. Avec un taux de régénération moyen de 40 % obtenu sur 28 taxons testés, la constitution d'une cryobanque est maintenant possible. L'optimisation de la survie post-cryoconservation passant par une meilleure connaissance des effets des solutions cryoprotectrices sur les cellules, des études microscopiques faisant appel notamment à la RTM (Real Time Microscopy) et la CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) ont été pratiquées. Elles ont permis de mettre en évidence, d'une part que la solution de vitrification (PVS2) provoque une contraction importante et rapide des cellules en agissant sur les parois et d'autre part que la solution de charge (LS), outre son rôle d'osmoticum, atténue les altérations dues à PVS2. Les travaux sur la régénération in vitro à partir d'apex ont montré que celle-ci était le plus souvent directe ce qui peut favoriser le maintien de la conformité. Ainsi, une plante obtenue après régénération d'un apex cryoconservé ou non, ne présente pas de modifications phénotypiques sauf chez certains cultivars chimériques. Enfin, des tests ELISA ont montré une augmentation du taux d'assainissement lors d'une régénération après cryoconservation par rapport à une simple culture d'apex pour deux virus (PFBV et PLPV). Cependant les immunolocalisations réalisées ont mis en évidence que les virus étaient toujours présents dans les apex, l'élimination n'étant que partielle. L'augmentation de ces connaissances devrait permettre une utilisation à plus grande échelle de la cryoconservation participant ainsi à une meilleure gestion de la conservation des ressources génétiques par une offre stratégique plus importante.

Mots clés: immunolocalisation; assainissement viral; Droplet-vitrification; microscopie

Mots clés: microscopy; virus eradication

Domaines: Biologie cellulaire

Anthony Gallard. Etude de la cryoconservation d'apex en vue d'une conservation à long terme de collections de ressources génétiques végétales : compréhension des phénomènes mis en jeu et évaluation de la qualité du matériel régénéré sur le modèle pelargonium. Biologie cellulaire. Université d'Angers, 2008. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00448693v2⟩