Mechanism of the water-splitting enzyme
Mécanisme de l'enzyme d'oxydation de l'eau
Résumé
Photosystem II uses solar energy to drive water oxidation and atmospheric O2 production. Its catalytic center comprises a cluster of four manganese and one calcium ions. The Mn4Ca cluster goes through five sequential oxidation states (S0 to S4) before O2 is evolved during the S4 to S0 transition. Although the Ca2+ ion is detected in the actual crystallographic structures, its role still needs to be clarified. A second cofactor is involved: the chloride, whose localization and role in the O2 evolution are unclear. To study both cofactors, we replaced biosynthetically the Ca2+ and the Cl- by Sr2+ and Br- in the thermophilic cyanobacteria Thermosynechococcus elongatus. In the substituted PSII, the O2 evolution under continuous illumination is decreased. It varies in the following order: Ca/Cl>Ca/Br>Sr/Cl>Sr/Br. In chapter III, we explain this activity decrease by a kinetic limitation of some of the electron transfer steps, in particular the S3 to S0 transition during which a lag phase is put in evidence. We demonstrate that this lag phase corresponds to a modification of the electrostatic environment of the chlorophyll P680, implying very likely proton movements. The significant slow down of the kinetics goes with a decrease of the free energy level of the S3 state and consequently with a decrease of the redox potential of the S3/S2 couple. In chapter IV, we study the exchangeability of the halide, and chloride is biochemically substituted with iodide. We observe a decrease of the catalytic activity due to the slowing down of the Mn4Ca cluster oxidation kinetics. The thermodynamic properties of PSII are also modified by the iodide, but the question still arises whether this is due to the reduction of the Mn4Ca cluster by I-, or to the increase of the redox potential of the S3/S2 couple. In chapter V, we focus on the structural aspects of the biosynthetically modified PSII samples. On one hand, we highlight the direct implication of Ca2+ in the binding of the substrate water molecules, and protonation/deprotonation phenomena during the S-states cycle. On the other hand, we show that our results support the existence of two halide binding sites.
L'oxydation de l'eau et la production du dioxygène atmosphérique sont réalisées par le Photosystème II. Le centre catalytique du PSII est constitué d'un cluster de 4 ions manganèse et de 1 ion calcium. Sous l'action de la lumière, le complexe Mn4Ca passe par 5 états d'oxydation successifs (S0 à S4) avant l'émission d'oxygène au cours de la transition S4 à S0. Bien que l'ion Ca2+ soit détecté dans les structures cristallographiques actuelles, son rôle reste à préciser. Un deuxième cofacteur est mis en jeu : le chlorure, dont la position et le rôle dans le dégagement d'oxygène ne sont pas clairement définis. Pour étudier ces deux cofacteurs, nous avons réalisé le remplacement biosynthétique du Ca2+ et du Cl- par du Sr2+ et/ou du Br- dans la cyanobactérie thermophile Thermosynechococcus elongatus. Le dégagement d'oxygène sous éclairement continu diminue après substitution des cofacteurs. Il varie dans l'ordre suivant : Ca/Cl>Ca/Br>Sr/Cl>Sr/Br. Dans le chapitre III, nous mettons en évidence que cette baisse d'activité est due à un ralentissement de certaines étapes du transfert d'électron, et plus particulièrement de la transition S3 à S0 durant laquelle une phase de délai a été mise en évidence. Nous montrons que cette phase de délai correspond à une modification de l'environnement électrostatique de la chlorophylle P680, impliquant très probablement des mouvements de protons. Nous arrivons ainsi à détecter un intermédiaire réactionnel au cours de la transition, grâce au ralentissement dû à l'échange des cofacteurs Ca2+ et Cl-. Ces cinétiques ralenties accompagnent une baisse du niveau d'énergie libre de l'état S3 et donc du potentiel d'oxydo-réduction du couple S3/S2. Dans le chapitre IV, le chlorure est remplacé biochimiquement par de l'iodure après une étude des conditions d'échangeabilité de l'halogénure. A nouveau, une baisse d'activité sous éclairement continu est expliquée par un ralentissement des cinétiques d'oxydation du cluster de Mn4Ca. Les propriétés thermodynamiques du PSII sont modifiées en présence d'Imais il reste à savoir si cela est dû à la réduction du cluster de Mn4Ca par l'iodure, ou à une augmentation du potentiel redox du couple S3/S2. Dans le chapitre V, nous nous intéressons à différents aspects structuraux des échantillons substitués biosynthétiquement. D'une part, nous mettons en évidence l'implication directe du Ca2+ dans la fixation des molécules d'eau substrat, ainsi que des phénomènes de protonation/déprotonation ayant lieu au cours du cycle des états Si. D'autre part, nous montrons que nos résultats sont en faveur de l'existence de deux sites de fixation aux halogénures.