heart valve tissue engineering : interest of cellular therapy techniques
Ingénierie tissulaire de valves cardiaques : apport des techniques de thérapie cellulaire
Résumé
Cardiac valvular prostheses currently marketed have important disadvantages. Biological prostheses (from allo or xenogenic origin) are subject to a progressive degeneration, and mechanical prostheses require life-long oral anticoagulation. New perspectives have emerged with tissue engineering, which aim at creating from a non cellularized scaffold (biodegradable polymer matrix of glycogen, or decellularized xenogenic matrix) a viable valve substitute with optimal hemodynamic performances and remodelling and growth capabilities. We developed a decellularized porcine xenograft model implanted in systemic and pulmonary position in a lamb and we tested several recolonization processes of the matrix by various cell types. The specificity of our project was to test the in vivo capability of autologous bone marrow cells to recolonize a valvular matrix. We supposed that the mechanical forces applied to the new created valve substitute would be responsible for cell recolonization and extracellular matrix regeneration. The first step was to optimize the decellularization process. We used a protocol combining the effects of hypotonic solutions and an anionic detergent, sodium dodecyl sulfate. The next step was to test the mechanical properties of a xenogenic decellularized valve implanted under systemic conditions in a sheep model (which is the reference model in valvular heart disease). A porcine decellularized valvular matrix was implanted in the descending thoracic aorta of 6 lambs.Mechanical properties were good under systemic conditions without any rupture or aneurismal dilatation, 2 to 16 weeks after implantation. We then tested the possibility to recolonize the decellularized xenogenic porcine valve by endogenous stem cells stimulated by the injection of Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF). This assembly has been implanted in 6 lambs and hemodynamic assessment, macroscopic and histologic examinations were conducted at 3, 6, 8 and 16 weeks. While the human G-CSF induced a significant increase in the number of peripheral white blood cells in the lamb, the effect on the valve was deleterious with induction of inflammatory reactions and fibrosis mimicking a rejection process after 16 weeks. We then tested the mechanical properties of the valve after implantation in the pulmonary artery trunk under cardio-pulmonary bypass and the effect of in situ injection of autologous mononuclear bone marrow cells (MBC) performed immediately before implantation. These decellularized porcine pulmonary valves were implanted in 15 lambs. In 9 animals, autologous MBC were injected into the valve immediately before implantation (MBC group) and in 6 animals, no cell injection was performed (control group). A follow-up of 16 weeks was achieved including a functional study of the valve (ultrasound echocardiography and angiography) and histological study. The ultrasound evaluations showed no valvular regurgitation in each groups and valvular permeability index were similar. Histological studies showed higher myointimal proliferation and calcium deposit in the control group compared with the MBC group. All valves were covered with a monolayer of endothelial cells. However in 2 animals of the control group, a significant inflammatory infiltration was found in the adventitia. These results suggested that in situ injection of autologous bone marrow cells could reduce the deterioration of the decellularized xenogenic valves but also in unknown circumstances promote local inflammatory reactions We then assumed that the in situ injection of a subset o fMBC, mesenchymal stem cells (MSC) could promote in vivo recolonization of valvular substitutes without risk of increased local inflammatory reactions. We harvested autologous MBC 7 days before surgical implantation. From this sample, mesenchymal stem cells (MSC) were isolated by specific.cell culture methods These decellularized porcine valves were injected with MBC (n = 7) or MSC (n = 7) and were implanted in the pulmonary artery trunk under cardio-pulmonary bypass in lambs. The functional assessment of the valves was performed after 16 weeks by ultrasound echocardiography and the valves were explanted for macroscopic and histologic analysis. After 4 months, mean transvalvular and distal gradients were significantly lower in the MSC group than in the MBC. The permeability index was also significantly higher in the MSC group than in the MBC group. Histological examination also showed that the disposition of the matrix and cell colonization was closer to that of native valve in the MSC group than in the MBC group
Les prothèses valvulaires cardiaques actuellement commercialisées présentent des inconvénients importants. Les prothèses biologiques (xéno ou allo greffes) sont soumises à une dégénérescence progressive, et les prothèses mécaniques nécessitent un traitement anticoagulant à vie. Des perspectives nouvelles sont apparues avec l'ingénierie tissulaire, dont le but est de créer à partir d'un support non cellularisé (matrice biodégradable de polymère de glycogène, ou xénogreffe décellularisée) un substitut valvulaire « vivant » offrant une meilleur longévité et des performances hémodynamiques optimales, ainsi que des capacités de remodelage et de croissance. Nous avons élaboré un modèle de xénogreffe porcine décellularise implanté en position systémique puis pulmonaire chez un agneau et testé plusieurs modes de recolonisation de cette matrice, par différents types de cellules. La spécificité de notre projet était de tester in vivo la possibilité de recolonisation de matrices valvulaires par des cellules autologues de moelle osseuse, les valves obtenues étant soumises à des forces mécaniques supposées être responsables de la recolonisation cellulaire et de la régénération de la matrice extra-cellulaire. La première étape a été l'optimisation d'un processus de décellularisation. Nous avons retenu un protocole combinant les effets de solutions hypotoniques et d'un détergent anionique, le sodium dodecyl sulfate. L'étape suivante a été de tester les propriétés mécaniques d'une valve xénogénique décellularisée dans un modèle ovin (qui est le modèle de référence en pathologie valvulaire cardiaque), en flux artériel systémique. Une matrice valvulaire porcine a été implantée dans une aorte thoracique descendante chez 6 agneaux. Ses propriétés mécaniques en contrainte systémique étaient bonnes, sans rupture ni dilatation anévrismale, 2 à 16 semaines après l'implantation. Nous avons ensuite testé la possibilité de colonisation de cette valve xénogénique décellularisée porcine par des cellules souches endogènes stimulées par l'injection de granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF). Ce montage a été implanté chez 6 agneaux puis une évaluation hémodynamique, macroscopique et histologique a été réalisée à 3, 6, 8 et 16 semaines. Alors que le G-CSF recombinant humain induisait une croissance significative du nombre de globules blancs périphériques chez l'agneau, l'effet sur la valve était délétère, et induisait des réactions inflammatoires et de fibrose ressemblant à un rejet de greffe après 16 semaines. Nous avons ensuite testé les propriétés mécaniques de cette valve après son implantation dans l'artère pulmonaire sous circulation extra-corporelle, ainsi que l'effet de l'injection in situ de cellules autologues mononucléées médullaires (CMM) juste avant l'implantation chirurgicale. Ces valves pulmonaires porcines décellularisées ont été implantées chez 15 agneaux. Chez 9 animaux, des CMM autologues ont été injectées dans la valve immédiatement avant son implantation (groupe CMM), et chez 6 animaux, aucune injection cellulaire n'était réalisée (groupe contrôle). Un suivi de 16 semaines était réalisé comprenant l'étude fonctionnelle de la valve (échographique et angiographique) ainsi qu'une étude histologique. Les évaluations échographiques ne montraient aucune régurgitation dans chacun des 2 groupes et les index de perméabilité valvulaire étaient similaires. Les études histologiques montraient une prolifération myointimale plus importante et des dépôts calciques étaient mis en évidence dans le groupe contrôle par rapport au groupe CMM. Toutes les valves étaient recouvertes d'une monocouche de cellules endothéliales. Cependant chez 2 animaux une infiltration inflammatoire importante était retrouvée dans l'adventice. Ces résultats suggéraient que l'injection in situ de cellules autologues médullaires pouvait réduire la détérioration de valves xénogéniques décellularisées, mais également dans des circonstances inconnues favoriser des réactions inflammatoires locales Nous avons alors supposé que l'injection in situ d'une sous-population de CMM, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) pouvaient promouvoir in vivo la recolonisation de nos substituts valvulaire sans entraîner de risque d'augmentation des réactions inflammatoires locales. Nous avons prélevé des CCM autologues 7 jours avant l'implantation chirurgicale. De cet échantillon, des cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été isolées par une culture cellulaire spécifique. Les valves porcines décellularisées ont été implantées dans l'artère pulmonaire sous circulation extra-corporelle chez l'agneau, ayant été au préalable injectées soit de CMM (n=7), soit de CSM (n=7). L'évaluation fonctionnelle des valves a été réalisée après 16 semaines par échographie, les valves ont été explantées en vue de leur analyse macroscopique et histologique. Après 4 mois, les gradients moyens transvalvulaires et distaux étaient significativement plus bas dans le groupe avec CSM que dans le groupe CMM. L'index de perméabilité était également significativement plus élevé dans le groupe CSM que dans le groupe CMM.. L'examen histologique montrait également que la disposition de la matrice et la colonisation cellulaire était plus proche de celle de valve native dans le groupe CSM que dans le groupe CMM.
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