Quantitative bioluminescent imaging adapted to a murine syngeneic lymphoma expressing human CD20: analyses of tumor burden influence on response to treatment by a monoclonal antibody, rituximab, and therapeutic effect of neutrons on gadolinium oxide nanoparticles.
Imagerie quantitative de bioluminescence appliquée à un modèle murin syngénique de lymphome exprimant le CD20 humain : analyses de l'influence du volume tumoral sur la réponse au traitement par un anticorps monoclonal, le rituximab, et de l'effet thérapeutique de neutrons et de nanoparticules chargées.
Résumé
Tumor burden influence on individual response to treatment, with a monoclonal antibody: the rituximab, by quantitative bioluminescence imaging in a syngenic murine model of lymphoma expressing human CD20.
In the last years, owing to advances carried out in the humanization of recombinant monoclonal antibodies (rmAb), these have seen an increase in their therapeutic use, especially in the treatment of cancer. Among these rmAb, rituximab (Mabthera®) was the first to get an approval in France and in the United Sates. This is a chimeric antibody of the IgG1 kappa type specific for the CD20 surface antigen expressed by more than 95 percent of B cells lymphomas. Rituximab used alone or in association with chemotherapy has shown its efficiency in the treatment of low and high grade lymphomas. Nevertheless, when it is used alone in therapy, 30 to 50% of the patients didn't respond to the treatment. Several hypotheses were evoked to explain this variability in response to treatment, among which importance of the tumor burden, a low level of CD20 expression, presence of soluble forms of CD20 or weak serum concentrations of rituximab. Thus, exposure to the drug and the tumor burden value could be factors of therapeutic variability to take into account individually to optimize the treatment of the patients reached of non Hodgkin's lymphoma.
The overall objective of this work of thesis was to analyze the respective role of tumor burden and pharmacokinetic parameters in the response to the rituximab by using systems of imagery adapted to murine models and to cancerology.
In a first part of development of the model we used a T lymphoma cell line (EL4) syngenic of mouse C57Bl6J, transduted by the human CD20 and transfected with luciferase gene (EL4-huCD20-Luc). We then defined the experimental conditions (cells number, route of administration, amount of potassium salt luciferin, mice strain, examinations periodicity) allowing to reproduce in the mouse the development of an aggressive and disseminated lymphoma with larges B cells and lethal within 30 to 40 days after inoculation. We developed a quantification method of the intensity of bioluminescence of the tumoral sources by taking into account the absorption coefficient of the light depending of the anatomical localization of each lymphoma tumor.
In a second part we studied the therapeutic effect of the rituximab on this lymphoma model. Only one injection of rituximab with gradually increasing amount (150 µg to 1000 µg) was carried out 13 days after the lymphoma cells inoculation (time necessary to the development of a quantifiable lymphoma by bioluminescence imaging). The circulating concentration of rituximab was evaluated by an ELISA method adapted to the analysis of small plasma volumes and to a murine model. In this model, we showed a relation between the administered dose and the survival of the mice; the totality of the mice being surviving to the amount of 1000 µg. It is with 500 µg that we found the greatest variability in response to the rituximab with approximately 23% of mice in complete response, 59% in partial response and 18% with a progressive disease. For the whole of the mice receiving this amount, we precisely determined tumor burden at the time of the rituximab injection and evaluated the concentrations to the waning of the treatment. We thus showed that there was a significant relation between tumor burden at the time of the injection and response to the rituximab; mice having lowest tumor burden having a better response and a prolonged survival. The analysis of the rituximab concentrations in the course of time enabled us to show a very important variability of exposure to the rituximab similar to the observation made for the human. We realized a model of the rituximab concentrations and of the tumors evolution, the construction of a concentration/effect (PK-PD) model allowing us to show the existence of a relation between the effectiveness of the rituximab and tumor burden before treatment.
Finally in a third part we used the cellular model EL4-huCD20-Luc in order to evaluate in vitro the use of gadolinium oxide particles or boron and gadolinium oxide particles. We checked the properties of contrast agents of these particles for the magnetic resonance imagery. We also showed the important radiating effect of these particles during an irradiation under a beam of neutrons after a step of insourcing of the particles within the cells. These results are very promising.
In the last years, owing to advances carried out in the humanization of recombinant monoclonal antibodies (rmAb), these have seen an increase in their therapeutic use, especially in the treatment of cancer. Among these rmAb, rituximab (Mabthera®) was the first to get an approval in France and in the United Sates. This is a chimeric antibody of the IgG1 kappa type specific for the CD20 surface antigen expressed by more than 95 percent of B cells lymphomas. Rituximab used alone or in association with chemotherapy has shown its efficiency in the treatment of low and high grade lymphomas. Nevertheless, when it is used alone in therapy, 30 to 50% of the patients didn't respond to the treatment. Several hypotheses were evoked to explain this variability in response to treatment, among which importance of the tumor burden, a low level of CD20 expression, presence of soluble forms of CD20 or weak serum concentrations of rituximab. Thus, exposure to the drug and the tumor burden value could be factors of therapeutic variability to take into account individually to optimize the treatment of the patients reached of non Hodgkin's lymphoma.
The overall objective of this work of thesis was to analyze the respective role of tumor burden and pharmacokinetic parameters in the response to the rituximab by using systems of imagery adapted to murine models and to cancerology.
In a first part of development of the model we used a T lymphoma cell line (EL4) syngenic of mouse C57Bl6J, transduted by the human CD20 and transfected with luciferase gene (EL4-huCD20-Luc). We then defined the experimental conditions (cells number, route of administration, amount of potassium salt luciferin, mice strain, examinations periodicity) allowing to reproduce in the mouse the development of an aggressive and disseminated lymphoma with larges B cells and lethal within 30 to 40 days after inoculation. We developed a quantification method of the intensity of bioluminescence of the tumoral sources by taking into account the absorption coefficient of the light depending of the anatomical localization of each lymphoma tumor.
In a second part we studied the therapeutic effect of the rituximab on this lymphoma model. Only one injection of rituximab with gradually increasing amount (150 µg to 1000 µg) was carried out 13 days after the lymphoma cells inoculation (time necessary to the development of a quantifiable lymphoma by bioluminescence imaging). The circulating concentration of rituximab was evaluated by an ELISA method adapted to the analysis of small plasma volumes and to a murine model. In this model, we showed a relation between the administered dose and the survival of the mice; the totality of the mice being surviving to the amount of 1000 µg. It is with 500 µg that we found the greatest variability in response to the rituximab with approximately 23% of mice in complete response, 59% in partial response and 18% with a progressive disease. For the whole of the mice receiving this amount, we precisely determined tumor burden at the time of the rituximab injection and evaluated the concentrations to the waning of the treatment. We thus showed that there was a significant relation between tumor burden at the time of the injection and response to the rituximab; mice having lowest tumor burden having a better response and a prolonged survival. The analysis of the rituximab concentrations in the course of time enabled us to show a very important variability of exposure to the rituximab similar to the observation made for the human. We realized a model of the rituximab concentrations and of the tumors evolution, the construction of a concentration/effect (PK-PD) model allowing us to show the existence of a relation between the effectiveness of the rituximab and tumor burden before treatment.
Finally in a third part we used the cellular model EL4-huCD20-Luc in order to evaluate in vitro the use of gadolinium oxide particles or boron and gadolinium oxide particles. We checked the properties of contrast agents of these particles for the magnetic resonance imagery. We also showed the important radiating effect of these particles during an irradiation under a beam of neutrons after a step of insourcing of the particles within the cells. These results are very promising.
Ces dernières années, grâce aux progrès réalisés dans l'humanisation des anticorps monoclonaux recombinants (Acm-r), ceux-ci ont vu leur utilisation thérapeutique s'accroître, notamment dans le traitement du cancer. Parmi ces Acm-r, le rituximab (MabThera®, Rituxan®) est le premier à avoir obtenu une autorisation de mise sur le marché en Europe et aux Etats-Unis. Il s'agit d'un anticorps chimérique de type IgG1 kappa dirigé contre l'antigène de surface CD20 exprimé par plus de 95% des cellules lymphoïdes B. Le rituximab utilisé seul ou en association avec de la chimiothérapie a montré son efficacité dans le traitement des lymphomes de faible et de haute malignité. Néanmoins, lorsqu'il est utilisé en monothérapie, 30 à 50% des patients ne répondent pas au traitement. Plusieurs hypothèses ont été évoquées pour expliquer cette variabilité de réponse, parmi lesquelles l'importance de la masse tumorale, un faible niveau d'expression du CD20, la présence de formes solubles de CD20 ou encore de faibles concentrations sériques de rituximab. Ainsi, l'exposition au médicament et la masse tumorale pourraient être des facteurs de variabilité thérapeutique à prendre en compte pour optimiser individuellement le traitement des patients atteints de lymphome malin non hodgkinien.
L'objectif général de ce travail de thèse a été d'analyser les rôles respectifs du volume tumoral et des paramètres pharmacocinétiques dans la réponse au rituximab en utilisant des moyens d'imagerie adaptés aux modèles murins et à la cancérologie.
Dans une première partie de mise au point du modèle, nous avons utilisé une lignée lymphomateuse T (EL4) syngénique de souris C57Bl6J, transduite par le CD20 humain que nous avons transfectée avec le gène de la luciférase (EL4-huCD20-Luc). Nous avons ensuite défini les conditions expérimentales (nombre de cellules, voie d'administration, dose de luciférine de potassium, fond génétique, périodicité des examens) permettant de reproduire chez la souris le développement d'un lymphome agressif et disséminé à larges cellules B létal dans un délai de 30 à 40 jours après inoculation. Nous avons mis au point une méthode de quantification de l'intensité de bioluminescence des foyers tumoraux en prenant en compte le coefficient d'absorption de la lumière propre à la localisation anatomique de chaque tumeur lymphomateuse.
Dans une seconde partie nous avons étudié l'effet thérapeutique du rituximab sur ce lymphome. Une seule injection de rituximab à dose progressivement croissante (de 150 µg à 1000 µg) a été réalisée 13 jours après l'inoculation des cellules lymphomateuses (temps nécessaire au développement d'un lymphome quantifiable par imagerie de bioluminescence). La concentration de rituximab circulant a été évaluée par une méthode ELISA adaptée à l'analyse de faibles volumes de plasma et à un modèle murin. Dans ce modèle, nous avons montré qu'il existait une relation entre la dose administrée et la survie des souris, la totalité des souris étant survivantes à la dose de 1000 µg. C'est à 500 µg que nous avons retrouvé la plus grande variabilité de réponse au rituximab avec environ 23% de souris totalement guéries, 59% en réponse partielle et 18% avec une maladie en progression. Pour l'ensemble des souris recevant cette dose, nous avons déterminé précisément le volume tumoral au moment de l'injection du rituximab et évalué les concentrations de rituximab au décours du traitement. Nous avons ainsi montré qu'il existait une relation significative entre le volume tumoral au moment de l'injection et la réponse au rituximab ; les souris présentant les plus faibles volumes tumoraux ayant une meilleure réponse et une survie prolongée. L'analyse de l'évolution des concentrations de rituximab au cours du temps nous a permis de montrer une très grande variabilité d'exposition à l'anticorps semblable à l'observation faite chez l'homme. Nous avons modélisé les concentrations de rituximab et la progression des foyers tumoraux par la construction d'un modèle concentration/effet (PK-PD) nous ayant permis de démontrer l'existence d'une relation entre l'efficacité du rituximab et le volume tumoral avant traitement.
Enfin dans un troisième volet nous avons utilisé le modèle cellulaire EL4-huCD20-Luc afin d'évaluer in vitro l'usage de particules d'oxydes de gadolinium ou de particules d'oxydes de gadolinium et de bore. Nous avons montré les qualités d'agents de contraste de ces particules pour l'imagerie à résonance magnétique. Nous avons aussi analysé l'important effet rayonnant de ces particules lors d'une irradiation sous un faisceau de neutrons après une étape d'internalisation des particules au sein des cellules.
L'objectif général de ce travail de thèse a été d'analyser les rôles respectifs du volume tumoral et des paramètres pharmacocinétiques dans la réponse au rituximab en utilisant des moyens d'imagerie adaptés aux modèles murins et à la cancérologie.
Dans une première partie de mise au point du modèle, nous avons utilisé une lignée lymphomateuse T (EL4) syngénique de souris C57Bl6J, transduite par le CD20 humain que nous avons transfectée avec le gène de la luciférase (EL4-huCD20-Luc). Nous avons ensuite défini les conditions expérimentales (nombre de cellules, voie d'administration, dose de luciférine de potassium, fond génétique, périodicité des examens) permettant de reproduire chez la souris le développement d'un lymphome agressif et disséminé à larges cellules B létal dans un délai de 30 à 40 jours après inoculation. Nous avons mis au point une méthode de quantification de l'intensité de bioluminescence des foyers tumoraux en prenant en compte le coefficient d'absorption de la lumière propre à la localisation anatomique de chaque tumeur lymphomateuse.
Dans une seconde partie nous avons étudié l'effet thérapeutique du rituximab sur ce lymphome. Une seule injection de rituximab à dose progressivement croissante (de 150 µg à 1000 µg) a été réalisée 13 jours après l'inoculation des cellules lymphomateuses (temps nécessaire au développement d'un lymphome quantifiable par imagerie de bioluminescence). La concentration de rituximab circulant a été évaluée par une méthode ELISA adaptée à l'analyse de faibles volumes de plasma et à un modèle murin. Dans ce modèle, nous avons montré qu'il existait une relation entre la dose administrée et la survie des souris, la totalité des souris étant survivantes à la dose de 1000 µg. C'est à 500 µg que nous avons retrouvé la plus grande variabilité de réponse au rituximab avec environ 23% de souris totalement guéries, 59% en réponse partielle et 18% avec une maladie en progression. Pour l'ensemble des souris recevant cette dose, nous avons déterminé précisément le volume tumoral au moment de l'injection du rituximab et évalué les concentrations de rituximab au décours du traitement. Nous avons ainsi montré qu'il existait une relation significative entre le volume tumoral au moment de l'injection et la réponse au rituximab ; les souris présentant les plus faibles volumes tumoraux ayant une meilleure réponse et une survie prolongée. L'analyse de l'évolution des concentrations de rituximab au cours du temps nous a permis de montrer une très grande variabilité d'exposition à l'anticorps semblable à l'observation faite chez l'homme. Nous avons modélisé les concentrations de rituximab et la progression des foyers tumoraux par la construction d'un modèle concentration/effet (PK-PD) nous ayant permis de démontrer l'existence d'une relation entre l'efficacité du rituximab et le volume tumoral avant traitement.
Enfin dans un troisième volet nous avons utilisé le modèle cellulaire EL4-huCD20-Luc afin d'évaluer in vitro l'usage de particules d'oxydes de gadolinium ou de particules d'oxydes de gadolinium et de bore. Nous avons montré les qualités d'agents de contraste de ces particules pour l'imagerie à résonance magnétique. Nous avons aussi analysé l'important effet rayonnant de ces particules lors d'une irradiation sous un faisceau de neutrons après une étape d'internalisation des particules au sein des cellules.
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