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Fiche détaillée Thèses
Université d'Orléans (17/12/2008), Dr. Ulysse Asseline (Dir.)
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Développement de nouvelles sondes oligonucléotidiques fluorescentes pour l'analyse des acides nucléiques
Brice-Loïc Renard1

De nouvelles sondes oligonucléotidiques fluorescentes spécifiques des structures d'acides nucléiques en double brin ont été obtenues. Ces oligonucléotides formant des triples hélices, sont liés par leurs extrémités 5'-ou/et 3' à une série de marqueurs fluorescents de la famille des cyanines monométhines possédant des propriétés intercalantes, par des bras polyméthylène de longueur variable. Dans tous les cas, l'hybridation des sondes avec les cibles en double brin s'accompagne d'une forte augmentation de l'intensité du signal fluorescent émis qui dépend de la structure de la cyanine et des paramètres de sa liaison aux oligonucléotides (longueur du bras de liaison et sa position de fixation sur les oligonucléotides et sur les marqueurs). En présence d'une cible simple brin, les modifications du signal ne sont pas significatives. La présence du marqueur stabilise les triples hélices. Les sondes comportant le thiazole orange, attaché par le noyau benzothiazole via un bras de liaison à huit méthylènes, présente le meilleur compromis en termes de stabilisation, d'intensité de fluorescence et d'augmentation d'intensité de fluorescence lors de l'hybridation.
Dans le but d'obtenir de nouvelles sondes utilisables en milieu cellulaire et in vivo, de nouveaux marqueurs fluorescents de type squaraine ont été synthétisés et couplés pour la première fois, à notre connaissance, à des oligonucléotides. Les conjugués correspondant émettent un signal fluorescent détectable au-delà de 650 nm et possèdent des rendements quantiques de fluorescence élevés. La photostabilité des marqueurs et des conjugués, en milieu acide faible et à 37 °C a été fortement augmentée après incorporation d'atomes de fluor sur le squaraine.
1 :  CBM - Centre de biophysique moléculaire
sondes oligonucléotidiques – détection d'acides nucléiques – synthèse oligonucléotidique – synthèse supportée – synthèse chimique – cyanines monométhines – squaraines – spectroscopies d'absorption et de fluorescence – marquage – proche infrarouge – duplex – triplex – oligonucléotides formant des triples hélices – propriétés d'hybridation – Tm

Development of new fluorescent oligonucleotide probes for nucleic acids analysis
New fluorescent oligonucleotide probes for the specific recognition of double-stranded nucleic acid structures were obtained. These triple helix forming oligonucleotides were linked through their 5'-or/and 3'-ends to a series of cyanine monomethine labels, with intercalating properties, via polymethylene linkers. In all cases, the hybridization of the labelled oligonucleotides with their double-stranded targets induced a strong increase of the fluorescence emission. The fluorescence increase was dependent on both the cyanine and the parameters of its linkage to the oligonucleotides (linker size and positions of its attachment to both the label and the oligonucleotide). In the presence of the single-stranded target, the fluorescence increase was weak. The triplex structures were stabilized by the presence of the labels. The probes involving thiazole orange attached by the benzothiazole ring and an octamethylene link provided the best balanced properties in terms of triplex stabilization, fluorescence intensity and fluorescence enhancement upon hybridization with the double-stranded target.
With the aim to obtain new probes that can be used in cellular and in vivo experiments, squaraine dyes were synthesized and used, for the first time to our knowledge, for the labelling of oligonucleotides. These squaraine-oligonucleotide conjugates are detectable beyond 650 nm and possess good quantum yields. The photophysical properties of the conjugates at 37 °C and in moderate acidic conditions can be strongly improved by the incorporation of fluorine atoms on the squaraine dye.
oligonucleotide probes – detection of nucleic acids – oligonucleotide synthesis – solid-phase synthesis – chemical synthesis – cyanines monomethines – squaraines – absorption and fluorescence spectroscopies – labelling – near- infrared – duplex – triplex – triplex forming oligonucleotides – hybridization properties – Tm

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