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Fiche détaillée Thèses
Université Sciences et Technologies - Bordeaux I (22/12/2006), Philippe Moretto (Dir.)
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Mise en évidence de cassures double brin de l'ADN induites par irradiation de kératinocytes humains en microfaisceau alpha
Thomas Pouthier1

Comprendre les modes d'interaction des rayonnements ionisants avec la matière vivante, notamment lors de l'exposition à de faibles doses telles que celles que l'on peut trouver dans un environnement industriel ou dans la nature, reste un enjeu majeur pour l'évaluation du risque associé. Il s'agit d'un problème de société qui n'a pu malheureusement trouver de réponse dans les études épidémiologiques classiques dans la mesure où les quelques données fiables concernent plutôt des expositions accidentelles à des doses beaucoup plus élevées. L'exposition naturelle représente pourtant la première source dans la vie courante juste devant les sources d'origines médicales (radiologie, radiothérapie). Ce type d'exposition est très difficile à reproduire en laboratoire sur des lignées cellulaires. La méthode principalement utilisée, basée sur l'irradiation aléatoire de populations cellulaires, consiste à calculer le nombre moyen de particules ayant interagi par cellule et repose ainsi sur des lois de distribution statistique (loi de Poisson). En plus des inévitables impacts multiples, la variété des cibles intracellulaires touchées (noyau, cytoplasme), les effets indirects induits par les impacts sur les cellules voisines ou simplement extracellulaires sont autant de phénomènes qui compliquent alors sérieusement l'interprétation des données.

Dans ce contexte, un microfaisceau de particules  a été développé au CENBG pour réaliser des irradiations ciblées à l'échelle sub-cellulaire avec une précision de quelques micromètres. Il est ainsi possible de contrôler le nombre exact de particules délivrées par cellule (jusqu'à la dose ultime d'un ion par cellule), de prédéterminer avec précision le point d'impact et d'irradier certaines cellules tout en vérifiant la réponse de cellules voisines.

La validation de ce dispositif a été réalisée au cours de ce travail de thèse, sur des kératinocytes humains exprimant une protéine recombinante nucléaire fluorescente (histone H2B-GFP) en mettant en évidence des dommages nucléaires radio-induits spécifiques et dose-dépendant. La combinaison de techniques telles que le microfaisceau d'ions, la microscopie confocale et l'analyse quantitative numérique a permis de mesurer, in situ et à l'échelle de la cellule unique, la cinétique de phosphorylation de la protéine histone H2A.X et d'aborder ainsi l'étude des processus de réparation de l'ADN et d'induction de l'apoptose. Les résultats expérimentaux ont validé la méthodologie développée en démontrant la reproductibilité du tir et le contrôle de la dose grâce à la mise en évidence d'une relation dose-effet qui a été également étudiée en fonction du temps.
1 :  CENBG - Centre d'Etudes Nucléaires de Bordeaux Gradignan
apoptose – y-H2AX – microfaisceau – cdb ADN – irradiation – keratinocyte – particules alpha

Investigation of DNA double strand breaks induced by alpha particle irradiation using CENBG microbeam in human keratinocytes
To understand the mechanisms of interaction of ionizing radiation with living tissues exposed to low and protracted doses remains a major issue for risk evaluation. The response cannot be found in epidemiological studies because the only available data concern accidental exposures to high doses of radiation. In addition, this kind of exposure is very difficult to reproduce in vitro by irradiating cell lines. The method per preference is based on random irradiation of cell populations. The mean number of particles interacting with cells is calculated on the basis of Poisson's statistics: inevitable multiple impacts, numerous potential intracellular targets (nuclei, cytoplasms...), indirect effects induced by the impact of particles on neighbouring cells or simply the extra-cellular targets, constitute phenomena that make more complex the interpretation of experimental data.
A charged particle microbeam was developed at CENBG to perform the targeted irradiation of individual cells with a few microns precision, to deliver a counted number of particles down to the ultimate dose (one alpha per cell), to target predetermined cells and observe the neighbouring cells response. This facility has been validated during this work on human keratinocyte cells expressing a recombinant fluorescent histone (H2B-GFP). Confocal microscopy and quantitative analysis allowed DNA double strand breaks measurement via histone H2A.X phosphorylation in single cells, DNA repair mechanism and apoptosis induction. Data obtained during this thesis validate the methodology we developed by demonstrating targeting reproducibility and dose control showed dose-effect relationship as a function of time.
apoptosis – y-H2AX – microbeam – DNA dsb – irradiation – keratinocyte – alpha particles

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