Development of anti-angiogenic and anti-tumoral therapy using VEGF-mRNA destabilizing activity of the zinc finger protein TIS11b.
Développement d'une thérapie anti-angiogène et anti-tumorale utilisant les propriétés de la protéine à doigts de zinc TIS11b
Résumé
In 2002, our team showed that stimulation of primary bovine adrenocortical cells byadrenocorticotropic hormone ACTH leads to a transcription-independent increase in VEGF expression. ACTH-induced VEGF expression is post-transcriptionally regulated through mRNA stabilization/destabilization via AU-rich elements (ARE) located in 3'-untranslated region (3'UTR) of VEGF mRNA. We previously characterized TIS11b as a zinc finger protein that is induced by ACTH concomitantly with VEGF regulation. TIS11b is a member of a protein family known for destabilizing short-lived mRNAs via ARE sequences. TIS11b interaction with VEGF mRNA has been subsequently confirmed and the implicated site has been identified.
In this context, the first aim of my thesis was to evaluate the possibility to develop a new anti-angiogenic and anti-tumoral strategy using the mRNA-destabilizing ability of TIS11b in order to decrease VEGF levels in living tumor cells. To this end, TIS11b cDNA has been fused with PTDs (protein transduction domain, Tat derived from HIV, or the polyarginine peptides R7 and R9). PTDs allowed TIS11b to enter living cells and to intracellularly target VEGF mRNA. We report here that 100 nM of Flag-R7- and Flag-R9-TIS11b fusion proteins decrease VEGF mRNA level as well as VEGF protein level, by 40% after 24h in cultured cells. Moreover, we showed that a single injection of Flag-R9-TIS11b fusion protein into mouse adrenal glands decreases VEGF expression levels to 50% of control. Preliminary encouraging results of tumour growth inhibition were obtained with fusion protein injection into pre-established LL2 tumours in nude mice.
ACTH is a pituitary hormone that activates cAMP synthesis and the protein kinase A (PKA) pathway. The second aim of my thesis was to characterize PKA-induced TIS11b phosphorylation in response to ACTH and to study its effect on TIS11b-mediated VEGF mRNA decay. For the first time, our team demonstrated that PKA phosphorylates TIS11b on serine 54 in vitro. A second ACTH-induced phosphorylation site, probably PKA-independent, has been identified on TIS11b-serine 334. These observations open a new field of investigation about the regulation of TIS11b mRNA destabilizing activity by specific phosphorylations.
In this context, the first aim of my thesis was to evaluate the possibility to develop a new anti-angiogenic and anti-tumoral strategy using the mRNA-destabilizing ability of TIS11b in order to decrease VEGF levels in living tumor cells. To this end, TIS11b cDNA has been fused with PTDs (protein transduction domain, Tat derived from HIV, or the polyarginine peptides R7 and R9). PTDs allowed TIS11b to enter living cells and to intracellularly target VEGF mRNA. We report here that 100 nM of Flag-R7- and Flag-R9-TIS11b fusion proteins decrease VEGF mRNA level as well as VEGF protein level, by 40% after 24h in cultured cells. Moreover, we showed that a single injection of Flag-R9-TIS11b fusion protein into mouse adrenal glands decreases VEGF expression levels to 50% of control. Preliminary encouraging results of tumour growth inhibition were obtained with fusion protein injection into pre-established LL2 tumours in nude mice.
ACTH is a pituitary hormone that activates cAMP synthesis and the protein kinase A (PKA) pathway. The second aim of my thesis was to characterize PKA-induced TIS11b phosphorylation in response to ACTH and to study its effect on TIS11b-mediated VEGF mRNA decay. For the first time, our team demonstrated that PKA phosphorylates TIS11b on serine 54 in vitro. A second ACTH-induced phosphorylation site, probably PKA-independent, has been identified on TIS11b-serine 334. These observations open a new field of investigation about the regulation of TIS11b mRNA destabilizing activity by specific phosphorylations.
En 2002, notre équipe a montré que la stimulation de cellules primaires cortico-surrénaliennes bovines en culture primaire par l'hormone hypophysaire ACTH induisait l'expression du VEGF de manière indépendante de sa transcription. En effet, en réponse à l'ACTH, l'expression du VEGF est régulée au niveau post-transcriptionnel par la stabilisation/déstabilisation de son transcrit via des séquences riches en AU (ARE) situées dans la région 3‘ non traduite (3'UTR) de son ARNm. Le laboratoire a mis en évidence une protéine, TIS11b, exprimée également en réponse à une stimulation des cellules par l'ACTH, mais de manière concomitante avec la phase de déstabilisation de l'ARNm du VEGF. TIS11b appartient à une famille de protéines déstabilisatrices des ARNm via les séquences ARE. L'interaction de TIS11b avec l'ARNm du VEGF a été confirmée par la suite, et le site de liaison de la protéine à l'ARNm a également été identifié.
Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse était d'évaluer la possibilité d'utiliser les propriétés déstabilisatrices de TIS11b sur l'ARNm du VEGF pour une thérapie anti-angiogène et anti-tumorale. Pour cela, la protéine a été vectorisée par la fusion de petits peptides ou PTD (protein transduction domain, Tat issu du VIH ou les polyarginines R7 et R9) lui permettant de traverser les membranes et d'atteindre sa cible intracellulaire, l'ARNm du VEGF. Nous avons pu montrer dans cette étude que 100 nM de protéines de fusion Flag-Tat-, Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b sont capables d'induire une diminution du taux d'ARNm du VEGF ainsi que de la production de la protéine VEGF, dans des cellules en culture après 24 h d'incubation. De plus, nous avons pu montrer que l'injection de 100 nM de la protéine de fusion Flag-R9-TIS11b dans la glande corticosurrénalienne de souris, induisait une diminution d'environ 50 % de l'expression du VEGF par cette glande et que cette diminution était maintenue à 48 h. Des résultats préliminaires encourageants d'inhibition de croissance tumorale ont été obtenus avec l'injection de cette protéine de fusion dans des tumeurs pré-établies chez la souris nude, et doivent être confirmés.
L'ACTH étant une hormone qui active la voie de l'AMPc et de la protéine kinase A (PKA), le deuxième objectif de ma thèse était de caractériser la phosphorylation de TIS11b par la PKA en réponse à une stimulation par l'ACTH et d'étudier les conséquences de cette phosphorylation sur son activité déstabilisatrice des ARNm. Nous avons pu montrer pour la première fois, que la PKA phosphoryle la protéine TIS11b, in vitro, au niveau de la sérine 54. Un deuxième site de phosphorylation en réponse à une stimulation par l'ACTH, via probablement une autre kinase que la PKA, a été mis en évidence au niveau de la sérine 334. Il semblerait que la protéine TIS11b comporte un domaine d'activation et un domaine d'inhibition susceptibles d'être régulés en réponse à une stimulation par l'ACTH. L'attribution de ces domaines aux sérines 54 et 334 nécessite des expériences complémentaires.
Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse était d'évaluer la possibilité d'utiliser les propriétés déstabilisatrices de TIS11b sur l'ARNm du VEGF pour une thérapie anti-angiogène et anti-tumorale. Pour cela, la protéine a été vectorisée par la fusion de petits peptides ou PTD (protein transduction domain, Tat issu du VIH ou les polyarginines R7 et R9) lui permettant de traverser les membranes et d'atteindre sa cible intracellulaire, l'ARNm du VEGF. Nous avons pu montrer dans cette étude que 100 nM de protéines de fusion Flag-Tat-, Flag-R7- et Flag-R9-TIS11b sont capables d'induire une diminution du taux d'ARNm du VEGF ainsi que de la production de la protéine VEGF, dans des cellules en culture après 24 h d'incubation. De plus, nous avons pu montrer que l'injection de 100 nM de la protéine de fusion Flag-R9-TIS11b dans la glande corticosurrénalienne de souris, induisait une diminution d'environ 50 % de l'expression du VEGF par cette glande et que cette diminution était maintenue à 48 h. Des résultats préliminaires encourageants d'inhibition de croissance tumorale ont été obtenus avec l'injection de cette protéine de fusion dans des tumeurs pré-établies chez la souris nude, et doivent être confirmés.
L'ACTH étant une hormone qui active la voie de l'AMPc et de la protéine kinase A (PKA), le deuxième objectif de ma thèse était de caractériser la phosphorylation de TIS11b par la PKA en réponse à une stimulation par l'ACTH et d'étudier les conséquences de cette phosphorylation sur son activité déstabilisatrice des ARNm. Nous avons pu montrer pour la première fois, que la PKA phosphoryle la protéine TIS11b, in vitro, au niveau de la sérine 54. Un deuxième site de phosphorylation en réponse à une stimulation par l'ACTH, via probablement une autre kinase que la PKA, a été mis en évidence au niveau de la sérine 334. Il semblerait que la protéine TIS11b comporte un domaine d'activation et un domaine d'inhibition susceptibles d'être régulés en réponse à une stimulation par l'ACTH. L'attribution de ces domaines aux sérines 54 et 334 nécessite des expériences complémentaires.