Laser preconditioning in membranous bone site
Préconditionnement Laser en site osseux membraneux.
Résumé
Objective: The application of a non lethal heat shock has been proven to limit the extent of subsequent injuries. This phenomenon known as preconditioning postulates that a supraphysiological stress prior to injury may have a cytoprotective effect.
Specific proteins called heat shock proteins (HSPs) are expressed physiologically after applying stress (mechanical, chemical or physical). In this study, the preconditioning response, already validated on various soft tissues, is assessed in bone tissue. This mechanism of preconditioning is a new approach in improving bone healing by employing its capacity for self protection. The hypothesis for this work is that the application of a well-defined heat stress could preserve bone subsequently injured with X-ray irradiation. For this purpose, this study required:
-- The establishment of laser treatment as a proven method of applying heat in order to achieve this protective effect.
-- A protocol for X-ray irradiation in order to induce bone tissue injury in a controlled and reproducible fashion.
-- The de novo development of a bone chamber model in order to study the superficial bone vascularisation as an indicator of the in vivo bone response.
-- A novel immunohistochemical method to highlight the presence of HSP70 (a stress-related form of HSP) in vivo.
Materials and Methods: In a preliminary study, the laser system was chosen and set to apply heat on bone at a well defined rate.
X-ray irradiation was defined in order to create a localized bone lesion and to limit subsequent injuries.
An original bone chamber model was implanted onto the skull of rabbits in order to monitor a specific bone site in the same animal. The superficial vascular network was observed through digital pictures taken weekly for a total of 12 weeks. A standardized image processing software evaluates vascular density and different morphological criteria: the total length of the vascular network, the number of nodes as well as the number of vessels classified by diameter size. In vivo experiments were conducted on 20 rabbits divided into four groups: group # 1: control group (n = 5); group # 2: laser treatment (n = 5), group # 3: X-ray radiation (n = 5); group # 4: laser preconditioning prior to X-ray radiation (n = 5).
Results: A diode laser system (815nm, 36J/cm ²: shot 1.5W for 3 sec) was used for preconditioning.
X-ray irradiation consisted of a single dose of 18.75 Gy applied with a low energy X-ray beam.
The vascular network was stable for group # 1 and group # 2. The in vivo study showed a significant reduction of each vascular network parameter for groups # 3 and # 4 which is characteristic of an X-ray-induced antiangiogenic effect. However, this reduction was limited in the laser preconditioning group # 4 vs. X-ray group # 3. This was particularly true for large vessels. Standard histology analysis confirmed these results.
Immunohistochemical analysis illustrated positive staining of HSP70 in a bone vascular network 18h after laser irradiation.
Discussion: Laser preconditioning preserved superficial bone damage induced by X-ray irradiation. For the first time, this cytoprotective effect has been described in a bone site. Our study demonstrated that the laser application, used as a localized and reproducible way to apply heat, increased tissue resistance against the antiangiogenic effect of X-ray irradiation. This protective effect was mainly observed in larger vessels. Immunohistochemical staining confirmed that laser preconditioning induced HSP70 (molecule chaperone) production in the vascular bone network. This innovative work introduces the concept of laser pre-treatment in order to promote bone healing following surgical trauma.
Specific proteins called heat shock proteins (HSPs) are expressed physiologically after applying stress (mechanical, chemical or physical). In this study, the preconditioning response, already validated on various soft tissues, is assessed in bone tissue. This mechanism of preconditioning is a new approach in improving bone healing by employing its capacity for self protection. The hypothesis for this work is that the application of a well-defined heat stress could preserve bone subsequently injured with X-ray irradiation. For this purpose, this study required:
-- The establishment of laser treatment as a proven method of applying heat in order to achieve this protective effect.
-- A protocol for X-ray irradiation in order to induce bone tissue injury in a controlled and reproducible fashion.
-- The de novo development of a bone chamber model in order to study the superficial bone vascularisation as an indicator of the in vivo bone response.
-- A novel immunohistochemical method to highlight the presence of HSP70 (a stress-related form of HSP) in vivo.
Materials and Methods: In a preliminary study, the laser system was chosen and set to apply heat on bone at a well defined rate.
X-ray irradiation was defined in order to create a localized bone lesion and to limit subsequent injuries.
An original bone chamber model was implanted onto the skull of rabbits in order to monitor a specific bone site in the same animal. The superficial vascular network was observed through digital pictures taken weekly for a total of 12 weeks. A standardized image processing software evaluates vascular density and different morphological criteria: the total length of the vascular network, the number of nodes as well as the number of vessels classified by diameter size. In vivo experiments were conducted on 20 rabbits divided into four groups: group # 1: control group (n = 5); group # 2: laser treatment (n = 5), group # 3: X-ray radiation (n = 5); group # 4: laser preconditioning prior to X-ray radiation (n = 5).
Results: A diode laser system (815nm, 36J/cm ²: shot 1.5W for 3 sec) was used for preconditioning.
X-ray irradiation consisted of a single dose of 18.75 Gy applied with a low energy X-ray beam.
The vascular network was stable for group # 1 and group # 2. The in vivo study showed a significant reduction of each vascular network parameter for groups # 3 and # 4 which is characteristic of an X-ray-induced antiangiogenic effect. However, this reduction was limited in the laser preconditioning group # 4 vs. X-ray group # 3. This was particularly true for large vessels. Standard histology analysis confirmed these results.
Immunohistochemical analysis illustrated positive staining of HSP70 in a bone vascular network 18h after laser irradiation.
Discussion: Laser preconditioning preserved superficial bone damage induced by X-ray irradiation. For the first time, this cytoprotective effect has been described in a bone site. Our study demonstrated that the laser application, used as a localized and reproducible way to apply heat, increased tissue resistance against the antiangiogenic effect of X-ray irradiation. This protective effect was mainly observed in larger vessels. Immunohistochemical staining confirmed that laser preconditioning induced HSP70 (molecule chaperone) production in the vascular bone network. This innovative work introduces the concept of laser pre-treatment in order to promote bone healing following surgical trauma.
Objectif: L'application d'un stress supraphysiologique (préconditionnement) induit une résistance cellulaire et tissulaire augmentée face à une agression secondaire. Des protéines appelées protéines de choc thermique (HSPs) sont exprimées physiologiquement suite à un stress qu'il soit de nature mécanique, chimique ou physique. Cette réponse, validée sur différents tissus mous, est évaluée ici en site osseux. Ce mécanisme de préconditionnement représente une nouvelle approche dans l'amélioration de la cicatrisation osseuse mettant en avant l'utilisation des capacités d'auto protection du tissu osseux. L'hypothèse de ce travail est qu'un stress thermique peut préserver le tissu osseux soumis secondairement à une irradiation aux rayons X. Pour valider cette hypothèse, cette étude nécessite:
- Le paramétrage du traitement laser requis en tant que moyen de chauffage pour induire le préconditionnement du tissu osseux.
- La détermination d'un protocole d'irradiation aux rayons X utilisé comme méthode quantifiable et reproductible de lésion secondaire
- Le développement d'un modèle d'étude de la vascularisation osseuse superficielle, indicateur de la réponse osseuse in vivo sur le long terme.
- La mise au point d'une technique d'immunohistochimie afin de caractériser les résultats obtenus lors de l'étude in vivo et de mettre en évidence la présence de HSP70 (forme inductible de HSP produite suite à un stress).
Matériels et Méthodes: Lors d'une étude préliminaire, le système laser est choisi et paramétré pour induire une augmentation contrôlée de la température osseuse.
Le protocole d'irradiation aux rayons X est défini pour créer une lésion osseuse localisée et pour limiter les effets secondaires au niveau des structures sous jacentes. Un modèle de chambre optique implantée sur le crâne de lapins est développé pour assurer le suivi longitudinal d'un même site osseux chez le même animal. Le réseau vasculaire superficiel est observé hebdomadairement pendant 12 semaines par la prise de photographies numériques. Un traitement informatique standardisé des images évalue la densité vasculaire, et différents critères morphologiques : longueur totale du réseau vasculaire, nombre de noeuds, et nombre de vaisseaux en fonction de leur diamètre. L'expérimentation in vivo est conduite sur 20 lapins divisés quatre groupes : groupe #1 : groupe contrôle (n=5); groupe #2: traitement laser (n=5); groupe #3 : irradiation par rayons X (n=5) ; groupe #4 : préconditionnement laser avant irradiation par rayons X (n=5).
L'analyse histologique et le marquage de HSP70 sont effectués sur des prélèvements osseux après la mise en place d'un protocole de fixation, décalcification et traitement immunohistochimique rigoureux.
Résultats: Un système diode-laser (815nm, 36J/cm² : un tir de 1.5W pendant 3 sec) est retenu pour le préconditionnement. L'irradiation aux rayons X consiste en dose unique de 18.75 Gy appliquée avec faisceau à rayons X de basse énergie.
Le réseau vasculaire est stable pour le groupe #1 et pour le groupe #2. Pour chaque critère observé, l'étude in vivo montre une chute significative pour les groupes #3 et #4 caractéristique de l'effet antiangiogénique des rayons X. Cependant, cette diminution vasculaire est limitée pour le groupe #4 vs. le groupe #3 et ceci en particulier pour les larges vaisseaux. L'analyse en histologie standard confirme ces résultats. Parallèlement, l'analyse immunohistochimique montre un marquage positif de HSP70 au niveau du réseau vasculaire osseux 18h après une irradiation laser.
Discussion: Le préconditionnement laser préserve la vascularisation osseuse superficielle des dommages induits par l'irradiation aux rayons X. Pour la première fois, cet effet cytoprotecteur est décrit en site osseux. Ainsi, notre étude montre que l'application laser utilisé comme méthode de chauffage localisée et reproductible, favorise la résistance aux effets antiangiogéniques des rayons X. Cet effet protecteur est observé in vivo au niveau vasculaire en particulier pour les vaisseaux les plus larges. Le marquage immunohistochimique confirme que le préconditionnement laser induit au niveau du réseau vasculaire osseux la production de HSP70, molécule chaperone décrite pour son action protectrice. Ce travail innovant offre la perspective d'accélérer et de favoriser la cicatrisation osseuse après une chirurgie programmée grâce à une mise en condition tissulaire.
- Le paramétrage du traitement laser requis en tant que moyen de chauffage pour induire le préconditionnement du tissu osseux.
- La détermination d'un protocole d'irradiation aux rayons X utilisé comme méthode quantifiable et reproductible de lésion secondaire
- Le développement d'un modèle d'étude de la vascularisation osseuse superficielle, indicateur de la réponse osseuse in vivo sur le long terme.
- La mise au point d'une technique d'immunohistochimie afin de caractériser les résultats obtenus lors de l'étude in vivo et de mettre en évidence la présence de HSP70 (forme inductible de HSP produite suite à un stress).
Matériels et Méthodes: Lors d'une étude préliminaire, le système laser est choisi et paramétré pour induire une augmentation contrôlée de la température osseuse.
Le protocole d'irradiation aux rayons X est défini pour créer une lésion osseuse localisée et pour limiter les effets secondaires au niveau des structures sous jacentes. Un modèle de chambre optique implantée sur le crâne de lapins est développé pour assurer le suivi longitudinal d'un même site osseux chez le même animal. Le réseau vasculaire superficiel est observé hebdomadairement pendant 12 semaines par la prise de photographies numériques. Un traitement informatique standardisé des images évalue la densité vasculaire, et différents critères morphologiques : longueur totale du réseau vasculaire, nombre de noeuds, et nombre de vaisseaux en fonction de leur diamètre. L'expérimentation in vivo est conduite sur 20 lapins divisés quatre groupes : groupe #1 : groupe contrôle (n=5); groupe #2: traitement laser (n=5); groupe #3 : irradiation par rayons X (n=5) ; groupe #4 : préconditionnement laser avant irradiation par rayons X (n=5).
L'analyse histologique et le marquage de HSP70 sont effectués sur des prélèvements osseux après la mise en place d'un protocole de fixation, décalcification et traitement immunohistochimique rigoureux.
Résultats: Un système diode-laser (815nm, 36J/cm² : un tir de 1.5W pendant 3 sec) est retenu pour le préconditionnement. L'irradiation aux rayons X consiste en dose unique de 18.75 Gy appliquée avec faisceau à rayons X de basse énergie.
Le réseau vasculaire est stable pour le groupe #1 et pour le groupe #2. Pour chaque critère observé, l'étude in vivo montre une chute significative pour les groupes #3 et #4 caractéristique de l'effet antiangiogénique des rayons X. Cependant, cette diminution vasculaire est limitée pour le groupe #4 vs. le groupe #3 et ceci en particulier pour les larges vaisseaux. L'analyse en histologie standard confirme ces résultats. Parallèlement, l'analyse immunohistochimique montre un marquage positif de HSP70 au niveau du réseau vasculaire osseux 18h après une irradiation laser.
Discussion: Le préconditionnement laser préserve la vascularisation osseuse superficielle des dommages induits par l'irradiation aux rayons X. Pour la première fois, cet effet cytoprotecteur est décrit en site osseux. Ainsi, notre étude montre que l'application laser utilisé comme méthode de chauffage localisée et reproductible, favorise la résistance aux effets antiangiogéniques des rayons X. Cet effet protecteur est observé in vivo au niveau vasculaire en particulier pour les vaisseaux les plus larges. Le marquage immunohistochimique confirme que le préconditionnement laser induit au niveau du réseau vasculaire osseux la production de HSP70, molécule chaperone décrite pour son action protectrice. Ce travail innovant offre la perspective d'accélérer et de favoriser la cicatrisation osseuse après une chirurgie programmée grâce à une mise en condition tissulaire.
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