Heterogeneity and maturation process of the human thyroperoxidase
Etude de l'hétérogenéite et de la maturation de la thyroperoxydase humaine
Résumé
The human thyroperoxidase (TPO) is the main enzyme involved in thyroid hormone synthesis. This type I membrane-bound glycoprotein expressed at the apical surface of thyrocytes catalyzes both the iodination of thyroglobulin and the coupling of some of the iodotyrosyl residues required for the formation of T3 and T4 thyroid hormones.
During its biosynthesis, the hTPO undergoes post-transcriptional mRNA modification by alternative splicing. Three isoforms have been already described: the hTPO1 (full lenght cDNA), the hTPO2 and the hTPO3 in which exons 10 and 16 are respectively spliced out. During my PhD, we identified and quantified by PCR, five novel spliced isoforms: the hTPO4 (- exon 14), the hTPO5 (- exon 8), the hTPO6 (- exons 10,12,13,14 and 16), the hTPO2/4 (- exons 10 and 14) and the hTPO2/3 (- exnos 10 and 16). These new spliced variants code for proteins with different stability, subcellular localization and enzymatic properties. Moreover we also showed that these splicing events increased in benign and malignant thyroid tissues and could be involved in the loss-of-function of thyroid hormones production observed in tumoral thyroid pathologies.
The hTPO undergoes co- and post-traductional modifications. In the endoplasmic reticulum the protein interact with a set of molecular « chaperone » involved in the properly folding and the quality control machinery of proteins, like calnexin (CNX) and calreticulin. We showed that the surexpression of CNX and its thiol oxido-reductase partner Erp57 did not increased the properly folding rate of the hTPO1. Contrary to CNX, we show that BiP, an other folding protein helper, impaired the maturation process and target hTPO for degradation. In the case of hTPO, BiP seems to be a sensor of the protein degradation pathway.
In a final set of experiments, we identified an N-terminal endoproteolytic cleavage of both hTPO purified from human thyroid gland and extracted from CHO cells. The enzyme implicated in the cleavage belong to the subtilisin-like proteases family, implicated in the maturation process of various receptors and surface proteins. As for the human myeloperoxidase, the prosequence of the hTPO acts as an internal molecular chaperone, helping the proper folding process of the protein.
All together, these results enlarged your understanding of mechanisms involved in the maturation of the hTPO and proposed an additional explanation of the heterogeneity of the hTPO expressed in the human thyroid gland.
During its biosynthesis, the hTPO undergoes post-transcriptional mRNA modification by alternative splicing. Three isoforms have been already described: the hTPO1 (full lenght cDNA), the hTPO2 and the hTPO3 in which exons 10 and 16 are respectively spliced out. During my PhD, we identified and quantified by PCR, five novel spliced isoforms: the hTPO4 (- exon 14), the hTPO5 (- exon 8), the hTPO6 (- exons 10,12,13,14 and 16), the hTPO2/4 (- exons 10 and 14) and the hTPO2/3 (- exnos 10 and 16). These new spliced variants code for proteins with different stability, subcellular localization and enzymatic properties. Moreover we also showed that these splicing events increased in benign and malignant thyroid tissues and could be involved in the loss-of-function of thyroid hormones production observed in tumoral thyroid pathologies.
The hTPO undergoes co- and post-traductional modifications. In the endoplasmic reticulum the protein interact with a set of molecular « chaperone » involved in the properly folding and the quality control machinery of proteins, like calnexin (CNX) and calreticulin. We showed that the surexpression of CNX and its thiol oxido-reductase partner Erp57 did not increased the properly folding rate of the hTPO1. Contrary to CNX, we show that BiP, an other folding protein helper, impaired the maturation process and target hTPO for degradation. In the case of hTPO, BiP seems to be a sensor of the protein degradation pathway.
In a final set of experiments, we identified an N-terminal endoproteolytic cleavage of both hTPO purified from human thyroid gland and extracted from CHO cells. The enzyme implicated in the cleavage belong to the subtilisin-like proteases family, implicated in the maturation process of various receptors and surface proteins. As for the human myeloperoxidase, the prosequence of the hTPO acts as an internal molecular chaperone, helping the proper folding process of the protein.
All together, these results enlarged your understanding of mechanisms involved in the maturation of the hTPO and proposed an additional explanation of the heterogeneity of the hTPO expressed in the human thyroid gland.
La thyroperoxydase humaine (hTPO) est l'enzyme clé de la biosynthèse des hormones
thyroïdiennes, impliquées dans de nombreux processus biologiques. Cette hémo-
glycoprotéine membranaire de type I est exprimée à la surface apicale des thyrocytes où elle
exerce ses fonctions d'iodation de certains résidus de tyrosine de la thyroglobuline et de
couplage de ces iodotyrosines pour former les hormones thyroïdiennes T3 et T4.
Lors de sa biosynthèse, la hTPO subit des modifications post-transcriptionnelles par
épissage alternatif du précurseur de l'ARNm. Trois isoformes de l'enzyme étaient connues :
la TPO1 (ADNc complet), la TPO2 et la TPO3 engendrées par épissage alternatif des exons
10 et 16 du précurseur de l'ARNm de la TPO. Dans cette thèse, nous avons identifié et
quantifié par PCR, cinq nouvelles isoformes toutes induites par des épissages alternatifs : la
TPO4 (sans exon 14), la TPO5 (sans exon 8), la TPO6 (sans exons 10, 12, 13, 14 et 16), la
TPO2/4 (sans exons 10 et 14), et la TPO2/3 (sans exons 10 et 16). Ces isoformes sont plus ou
moins stables, actives ou non et transportées correctement ou non jusqu'à la membrane
plasmique.
Nous avons également démontré, comme pour d'autres cas de pathologie cancéreuse,
l'augmentation des phénomènes d'épissage alternatif de la hTPO en association avec une
diminution globale du taux d'expression transcriptionnel de la protéine dans les différents
types de cancers thyroïdiens.
La hTPO subit également des modifications co- et post-traductionnelles. Elle interagit
en particulier avec les « protéines chaperons » du réticulum endoplasmique (RE), qui aident
les protéines nouvellement synthétisées à se replier correctement et font partie du “contrôle de
qualité” du RE. On sait que la hTPO est largement retenue au niveau du réticulum
endoplasmique et subissait un processus de dégradation faisant intervenir d'une part le
protéasome et d'autre part des protéases du RE. Le repliement correct de la hTPO nécessite
des interactions avec la calnexine (CNX) et la calreticuline. Dans cette thèse, nous montrons
que la co-surexpression de la CNX et de ERp57, impliquée dans la formation des ponts
disulfures des protéines interagissant avec la CNX, n'augmente pas la proportion des formes
correctement repliées, ce qui suggère l'implication d'autres protéines chaperons et/ou de
catalyseurs de repliement dans le processus de maturation de la hTPO. Nous montrons qu'à
l'inverse de la CNX, l'interaction avec une autre protéine chaperon appelée BiP, diminue le
repliement de la hTPO et entraîne la protéine vers la dégradation, suggérant ainsi que BiP
pourrait être un des senseurs de la dégradation de la hTPO.
Nous avons aussi montré que la thyroperoxydase purifiée à partir de thyroïde humaine
ou exprimée dans les CHO subit un clivage endoprotéolytique dans sa partie N-terminale.
L'enzyme impliquée dans ce clivage appartient vraisemblablement à la famille des protéines
convertases, endoprotéases impliquées dans la maturation de nombreux précurseurs de
pro-récepteurs et glycoprotéines de surface. A l'instar d'une autre protéine de la famille des
peroxydases, la myéloperoxydase humaine, la proséquence de la hTPO agit comme une
protéine chaperon interne en facilitant le repliement correct de la protéine.
Ces résultats éclairent davantage notre connaissance des mécanismes impliqués dans la
maturation de la hTPO et expliquent l'hétérogénéité de la TPO exprimée dans la thyroïde
humaine.
thyroïdiennes, impliquées dans de nombreux processus biologiques. Cette hémo-
glycoprotéine membranaire de type I est exprimée à la surface apicale des thyrocytes où elle
exerce ses fonctions d'iodation de certains résidus de tyrosine de la thyroglobuline et de
couplage de ces iodotyrosines pour former les hormones thyroïdiennes T3 et T4.
Lors de sa biosynthèse, la hTPO subit des modifications post-transcriptionnelles par
épissage alternatif du précurseur de l'ARNm. Trois isoformes de l'enzyme étaient connues :
la TPO1 (ADNc complet), la TPO2 et la TPO3 engendrées par épissage alternatif des exons
10 et 16 du précurseur de l'ARNm de la TPO. Dans cette thèse, nous avons identifié et
quantifié par PCR, cinq nouvelles isoformes toutes induites par des épissages alternatifs : la
TPO4 (sans exon 14), la TPO5 (sans exon 8), la TPO6 (sans exons 10, 12, 13, 14 et 16), la
TPO2/4 (sans exons 10 et 14), et la TPO2/3 (sans exons 10 et 16). Ces isoformes sont plus ou
moins stables, actives ou non et transportées correctement ou non jusqu'à la membrane
plasmique.
Nous avons également démontré, comme pour d'autres cas de pathologie cancéreuse,
l'augmentation des phénomènes d'épissage alternatif de la hTPO en association avec une
diminution globale du taux d'expression transcriptionnel de la protéine dans les différents
types de cancers thyroïdiens.
La hTPO subit également des modifications co- et post-traductionnelles. Elle interagit
en particulier avec les « protéines chaperons » du réticulum endoplasmique (RE), qui aident
les protéines nouvellement synthétisées à se replier correctement et font partie du “contrôle de
qualité” du RE. On sait que la hTPO est largement retenue au niveau du réticulum
endoplasmique et subissait un processus de dégradation faisant intervenir d'une part le
protéasome et d'autre part des protéases du RE. Le repliement correct de la hTPO nécessite
des interactions avec la calnexine (CNX) et la calreticuline. Dans cette thèse, nous montrons
que la co-surexpression de la CNX et de ERp57, impliquée dans la formation des ponts
disulfures des protéines interagissant avec la CNX, n'augmente pas la proportion des formes
correctement repliées, ce qui suggère l'implication d'autres protéines chaperons et/ou de
catalyseurs de repliement dans le processus de maturation de la hTPO. Nous montrons qu'à
l'inverse de la CNX, l'interaction avec une autre protéine chaperon appelée BiP, diminue le
repliement de la hTPO et entraîne la protéine vers la dégradation, suggérant ainsi que BiP
pourrait être un des senseurs de la dégradation de la hTPO.
Nous avons aussi montré que la thyroperoxydase purifiée à partir de thyroïde humaine
ou exprimée dans les CHO subit un clivage endoprotéolytique dans sa partie N-terminale.
L'enzyme impliquée dans ce clivage appartient vraisemblablement à la famille des protéines
convertases, endoprotéases impliquées dans la maturation de nombreux précurseurs de
pro-récepteurs et glycoprotéines de surface. A l'instar d'une autre protéine de la famille des
peroxydases, la myéloperoxydase humaine, la proséquence de la hTPO agit comme une
protéine chaperon interne en facilitant le repliement correct de la protéine.
Ces résultats éclairent davantage notre connaissance des mécanismes impliqués dans la
maturation de la hTPO et expliquent l'hétérogénéité de la TPO exprimée dans la thyroïde
humaine.