Modification of insect cell glycosylation
Modification des capacités de glycosylation des cellules d'insectes
Résumé
One limitation to the therapeutic use of insect cell-produced recombinant glycoproteins is their glycosylation potential which mainly leads to short O- and N-glycans. Thus, our work is part of a global effort to "humanize" the glycoproteins produced in Lepidopteran cells.
Our first concern was to understand the N-glycan processing pathway by metabolically labeling Sf9 cells. The use of processing inhibitors and of an intracellular trafficking inhibitor led us to the identification of key intermediates, thus confirming the hypothesis that the N-glycan processing pathway in insect cells parallels the one of mammalian cells up until the formation of the GlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2. In insects, this structure is the substrate for a β-N-acetylglucosaminidase, yielding Man3[Fuc]GlcNAc2.
Nonetheless, this processing pathway can be diverted to the synthesis of complex-type N-glycans by adding the lacking glycosyltransferases. As an example, the expression of a β1,4-galactosyltransferase allows the formation of GalGlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2.
We were then interested in engineering the sialylation in insect cells, which is complicated by the lack of the sialic acid donor, CMP-Neu5Ac. Our strategy was to express Trypanosoma cruzi trans-sialidase on the plasma membrane of insect cells, so that the enzyme can sialylate secreted glycoproteins, using sialylated donors from the medium. The construction was expressed by a baculovirus vector and found to encode an active enzyme which is partially located on the membrane and in the envelope of viral particles, while an increasing amount is soluble. However, the system can achieve the quantitative sialylation of exogenous acceptors.
Our study contributes to demonstrate that engineering the glycosylation pathways in insect cells can be considered. The trans-sialidase is a potential alternative to sialyltransferases to address the question of the sialylation.
Our first concern was to understand the N-glycan processing pathway by metabolically labeling Sf9 cells. The use of processing inhibitors and of an intracellular trafficking inhibitor led us to the identification of key intermediates, thus confirming the hypothesis that the N-glycan processing pathway in insect cells parallels the one of mammalian cells up until the formation of the GlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2. In insects, this structure is the substrate for a β-N-acetylglucosaminidase, yielding Man3[Fuc]GlcNAc2.
Nonetheless, this processing pathway can be diverted to the synthesis of complex-type N-glycans by adding the lacking glycosyltransferases. As an example, the expression of a β1,4-galactosyltransferase allows the formation of GalGlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2.
We were then interested in engineering the sialylation in insect cells, which is complicated by the lack of the sialic acid donor, CMP-Neu5Ac. Our strategy was to express Trypanosoma cruzi trans-sialidase on the plasma membrane of insect cells, so that the enzyme can sialylate secreted glycoproteins, using sialylated donors from the medium. The construction was expressed by a baculovirus vector and found to encode an active enzyme which is partially located on the membrane and in the envelope of viral particles, while an increasing amount is soluble. However, the system can achieve the quantitative sialylation of exogenous acceptors.
Our study contributes to demonstrate that engineering the glycosylation pathways in insect cells can be considered. The trans-sialidase is a potential alternative to sialyltransferases to address the question of the sialylation.
L'utilisation thérapeutique de glycoprotéines recombinantes produites dans le système baculovirus-cellules d'insectes reste limitée par le potentiel de glycosylation de ces cellules, qui produisent essentiellement des structures O- et N-glycanniques courtes. Notre travail s'inscrit donc dans un effort global d'"humanisation" de la glycosylation des protéines produites dans les cellules de Lépidoptères.
Nous nous sommes d'abord attachés à comprendre la voie de maturation des N-glycannes dans des cellules Sf9. L'utilisation d'inhibiteurs de la maturation ou du trafic intracellulaire nous a permis d'identifier des intermédiaires clés et de confirmer l'hypothèse que la maturation des N-glycannes dans les cellules d'insectes et de mammifères suivent un chemin métabolique parallèle jusqu'à la formation de l'espèce GlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2. Chez les insectes, cette structure est ensuite substrat d'une β-N-acétylglucosaminidase qui produit l'espèce finale Man3[Fuc]GlcNAc2.
Cette voie de maturation peut néanmoins être déviée vers la synthèse de N-glycannes de type complexe par l'addition de glycosyltransférases absentes : ainsi, l'expression d'une β1,4-galactosyltransférase permet la synthèse de l'espèce GalGlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2.
Notre intérêt s'est ensuite porté sur l'ingénierie de la sialylation dans les cellules d'insectes, compliquée par l'absence du donneur d'acides sialiques, le CMP-Neu5Ac. Notre stratégie a été d'exprimer la trans-sialidase de Trypanosoma cruzi sur la membrane plasmique des cellules, afin qu'elle puisse sialyler les glycoprotéines sécrétées en utilisant des donneurs du milieu. La construction exprimée grâce à un vecteur baculovirus code une enzyme active, dont une partie est retrouvée sur la membrane plasmique et sur l'enveloppe des particules virales, tandis qu'une partie, croissante avec l'infection, est soluble. Néanmoins, le système permet une sialylation quantitative d'accepteurs exogènes.
Notre étude contribue à montrer que l'ingénierie de la glycosylation dans le système baculovirus-cellules d'insectes est envisageable. Pour résoudre le problème de la sialylation, la trans-sialidase est une alternative possible aux sialyltransférases.
Nous nous sommes d'abord attachés à comprendre la voie de maturation des N-glycannes dans des cellules Sf9. L'utilisation d'inhibiteurs de la maturation ou du trafic intracellulaire nous a permis d'identifier des intermédiaires clés et de confirmer l'hypothèse que la maturation des N-glycannes dans les cellules d'insectes et de mammifères suivent un chemin métabolique parallèle jusqu'à la formation de l'espèce GlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2. Chez les insectes, cette structure est ensuite substrat d'une β-N-acétylglucosaminidase qui produit l'espèce finale Man3[Fuc]GlcNAc2.
Cette voie de maturation peut néanmoins être déviée vers la synthèse de N-glycannes de type complexe par l'addition de glycosyltransférases absentes : ainsi, l'expression d'une β1,4-galactosyltransférase permet la synthèse de l'espèce GalGlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2.
Notre intérêt s'est ensuite porté sur l'ingénierie de la sialylation dans les cellules d'insectes, compliquée par l'absence du donneur d'acides sialiques, le CMP-Neu5Ac. Notre stratégie a été d'exprimer la trans-sialidase de Trypanosoma cruzi sur la membrane plasmique des cellules, afin qu'elle puisse sialyler les glycoprotéines sécrétées en utilisant des donneurs du milieu. La construction exprimée grâce à un vecteur baculovirus code une enzyme active, dont une partie est retrouvée sur la membrane plasmique et sur l'enveloppe des particules virales, tandis qu'une partie, croissante avec l'infection, est soluble. Néanmoins, le système permet une sialylation quantitative d'accepteurs exogènes.
Notre étude contribue à montrer que l'ingénierie de la glycosylation dans le système baculovirus-cellules d'insectes est envisageable. Pour résoudre le problème de la sialylation, la trans-sialidase est une alternative possible aux sialyltransférases.
Loading...