Role of Rim101p in the pH response in Candida albicans
LE RÔLE DE RIM101p DANS LA RÉPONSE AU pH CHEZ CANDIDA ALBICANS
Résumé
Rim101p is a conserved fungal transcription factor that becomes activated through C-terminal cleavage under neutral to alkaline conditions. The identification and analysis of Rim101p targets in Candida albicans was the main subject of the PhD thesis.
A constitutively active truncated version of Rim101p (Rim101SLp) was introduced under the control of the MET3-promotor into a rim101 null mutant to monitor Rim101-dependent transcriptional changes independently of other pH-dependent regulatory events. Transcriptional changes were recorded using microarrays along a time course following induction of RIM101SL transcription.
After filtering the data, the transcriptional patterns of 133 selected genes was clustered into five distinct classes. Significantly more putative Rim101p binding sites were detected in the promoters of these genes than in a randomly chosen set of genes. Further analysis permitted to identify a putative extended Rim101p binding motif. Putative Rim101p targets were examined for predicted functions and amino acid landmarks like transmembrane domains and signal peptides that could indicate localization at the cell surface and thus a possible involvement in host interaction.
Microarray results were confirmed on 20 selected genes by quantitative real-time PCR. Furthermore, the relevance of the microarray data for the pH response of C. albicans was assessed by monitoring transcriptional changes of these genes in a wild type strain grown at pH 4 or pH 8. In spite of these experimental setup differences, a clear correlation of the results was observed for a large majority of the tested genes.
Microarray data suggested that Rim101p activity had a strong impact on the expression of genes of the ALS (Agglutinin-Like Sequence) gene family. The extremely high sequence conservation within this family hampered however a gene-specific analysis. Using a gene-specific primer set, transcription of each member of the ALS gene family was analyzed by real-time qPCR. Four ALS genes were shown to be transcribed in a pH-dependent manner, and Rim101p was found to be required for the alkaline induction of ALS1 and the repression of ALS4. The two other genes, ALS2 and ALS9, were also repressed at alkaline pH, but their regulation was at least partially independent of Rim101p.
Finally, the mechanism of ALS1 and ALS4 regulation was addressed by two different approaches. First, reporter strains that put a modified bacterial Β-galactosidase gene under the control of ALS promoters were constructed in order to monitor more easily pH and Rim101p effects on ALS1 and ALS4 expression. Second, a tagged version of Rim101p was used to demonstrate in vivo binding of Rim101p to ALS promoters by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP): however, no clear specific binding could be observed.
A constitutively active truncated version of Rim101p (Rim101SLp) was introduced under the control of the MET3-promotor into a rim101 null mutant to monitor Rim101-dependent transcriptional changes independently of other pH-dependent regulatory events. Transcriptional changes were recorded using microarrays along a time course following induction of RIM101SL transcription.
After filtering the data, the transcriptional patterns of 133 selected genes was clustered into five distinct classes. Significantly more putative Rim101p binding sites were detected in the promoters of these genes than in a randomly chosen set of genes. Further analysis permitted to identify a putative extended Rim101p binding motif. Putative Rim101p targets were examined for predicted functions and amino acid landmarks like transmembrane domains and signal peptides that could indicate localization at the cell surface and thus a possible involvement in host interaction.
Microarray results were confirmed on 20 selected genes by quantitative real-time PCR. Furthermore, the relevance of the microarray data for the pH response of C. albicans was assessed by monitoring transcriptional changes of these genes in a wild type strain grown at pH 4 or pH 8. In spite of these experimental setup differences, a clear correlation of the results was observed for a large majority of the tested genes.
Microarray data suggested that Rim101p activity had a strong impact on the expression of genes of the ALS (Agglutinin-Like Sequence) gene family. The extremely high sequence conservation within this family hampered however a gene-specific analysis. Using a gene-specific primer set, transcription of each member of the ALS gene family was analyzed by real-time qPCR. Four ALS genes were shown to be transcribed in a pH-dependent manner, and Rim101p was found to be required for the alkaline induction of ALS1 and the repression of ALS4. The two other genes, ALS2 and ALS9, were also repressed at alkaline pH, but their regulation was at least partially independent of Rim101p.
Finally, the mechanism of ALS1 and ALS4 regulation was addressed by two different approaches. First, reporter strains that put a modified bacterial Β-galactosidase gene under the control of ALS promoters were constructed in order to monitor more easily pH and Rim101p effects on ALS1 and ALS4 expression. Second, a tagged version of Rim101p was used to demonstrate in vivo binding of Rim101p to ALS promoters by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP): however, no clear specific binding could be observed.
Rim101p est un facteur de transcription qui est activé par cleavage N-terminale à pH alcalin. Il régule ainsi la réponse au pH et joue aussi un rôle majeur dans la pathogenèse de la levure Candida albicans. Mon projet est d'identifier et d'étudier des gènes de surface régulés par Rim101p qui ont une fonction dans l'interaction hôte-levure.
Une analyse du transcriptome suite à l'induction d'une forme tronquée et constitutivement active de Rim101p nous avait permis d'identifier et de classer 133 gènes qui semblent être des cibles de Rim101p. Les données des microarrays ont été confirmées pour 20 gènes par PCR quantitative, en utilisant des conditions plus physiologiques.
Plusieurs adhésines de la famille des gènes ALS (Agglutinin-Like-Sequence) qui comporte 8 gènes semblent être régulé par Rim101p. Certaines jouent un rôle important dans la formation des biofilms et ainsi dans la virulence de C.albicans. Malgré la grande ressemblance des gènes au niveau de leur séquence nous avons pu confirmer le rôle de Rim101p dans la régulation d'au moins deux gènes ALS (ALS1 et ALS4) dans une analyse de la famille entière en PCR quantitative avec des oligos gène-spécifiques.
Pour analyser la régulation de ces gènes au niveau de leur promoteur, des fusions avec le gène rapporteur « LacZ » ont été intégré dans le génome de C. albicans et l'activité de la Β-Galactosidase a été quantifiée en fonction du pH et de la présence ou absence de Rim101p. Nous avons abandonné ce projet car les résultats n'étaient pas reproductibles et cohérents avec les quantifications directes des transcripts.
Finalement nous avons utilisé une souche qui porte une version étiquetée de Rim101 avec l'étiquette V5 pour essayer de mettre en évidence par in vivo chromatine immunoprécipitation (ChIP) que les promoteurs sont des cibles directes de Rim101p. Nos résultats indiquaient un enrichissement
Dans un dernier projet, nous avons essayé de mettre en évidence par des approches d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) que les promoteurs étient des cibles directes de Rim101p en utilisant une souche qui exprimait une version de Rim101p étiquetée avec l'épitope V5. Nous avons observé un plus grand nombre des promoteurs cibles dans les échantillons pris à pH alcalin que dans ceux pris à pH acides. Toutefois, ces résultats n'étaient pas très solides, car la reproductibilité était faible et nous avons occasionnellement observé un enrichissement similaire pour des promoteurs non-régulés utilisés comme contrôles dans ces expériences.
Une analyse du transcriptome suite à l'induction d'une forme tronquée et constitutivement active de Rim101p nous avait permis d'identifier et de classer 133 gènes qui semblent être des cibles de Rim101p. Les données des microarrays ont été confirmées pour 20 gènes par PCR quantitative, en utilisant des conditions plus physiologiques.
Plusieurs adhésines de la famille des gènes ALS (Agglutinin-Like-Sequence) qui comporte 8 gènes semblent être régulé par Rim101p. Certaines jouent un rôle important dans la formation des biofilms et ainsi dans la virulence de C.albicans. Malgré la grande ressemblance des gènes au niveau de leur séquence nous avons pu confirmer le rôle de Rim101p dans la régulation d'au moins deux gènes ALS (ALS1 et ALS4) dans une analyse de la famille entière en PCR quantitative avec des oligos gène-spécifiques.
Pour analyser la régulation de ces gènes au niveau de leur promoteur, des fusions avec le gène rapporteur « LacZ » ont été intégré dans le génome de C. albicans et l'activité de la Β-Galactosidase a été quantifiée en fonction du pH et de la présence ou absence de Rim101p. Nous avons abandonné ce projet car les résultats n'étaient pas reproductibles et cohérents avec les quantifications directes des transcripts.
Finalement nous avons utilisé une souche qui porte une version étiquetée de Rim101 avec l'étiquette V5 pour essayer de mettre en évidence par in vivo chromatine immunoprécipitation (ChIP) que les promoteurs sont des cibles directes de Rim101p. Nos résultats indiquaient un enrichissement
Dans un dernier projet, nous avons essayé de mettre en évidence par des approches d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) que les promoteurs étient des cibles directes de Rim101p en utilisant une souche qui exprimait une version de Rim101p étiquetée avec l'épitope V5. Nous avons observé un plus grand nombre des promoteurs cibles dans les échantillons pris à pH alcalin que dans ceux pris à pH acides. Toutefois, ces résultats n'étaient pas très solides, car la reproductibilité était faible et nous avons occasionnellement observé un enrichissement similaire pour des promoteurs non-régulés utilisés comme contrôles dans ces expériences.