Underivatized Amino Acids Analysis by Liquid Chromatography using Evaporative Light Scattering Detectionand Mass Spectrometry
Analyse d'Acides Aminés non dérivés par Chromatographie en Phase Liquide avec le Détecteur Evaporatif à Diffusion de la Lumière et Couplage avec la Spectrométrie de Masse
Résumé
Amino acids represent one of the most important classes of natural compounds. They take in many biological processes the most important of which is the formation of peptides and proteins. Since most of them are lacking in a chromophore group, the majority of the chromatographic methods proposed for their determination in mixtures involves pre- or post-column derivatization allowing a spectrophotometric detection.
In order to avoid the derivatization step, Liquid Chromatography (LC) was coupled with an Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) or coupled with Mass Spectrometry (MS). Both detection modes are practically universal but require the development of volatile mobile phases.
Among all the LC systems tried, porous graphitic carbon was chosen and evaluated as stationary phase for underivatized amino acid analysis. Separation of sulfur amino acids (taurine analogous) and partial separations of proteinic amino acids have been obtained using an aqueous volatile mobile phase containing ammonium acetate ajusted to pH=9.3. A complete separation of the 20 underivatized proteinic amino acids was achieved using a mobile phase containing a perfluorinated carboxylic acid (nonafluoropentanoic acid) as volatile ion pairing agent, in a gradient elution mode, at 10°C, in approximatively 40 minutes.
LC systems that have been developed with an ESLD are directly transposable with MS. With the higher specificity of MS or MS tandem detection, the analysis of the 20 underivatized proteinic amino acids is achieved in 20 minutes. While ELSD does not permit detection limits below the mg/l level, MS tandem allows the detection of only about ten µg/l. Thus, direct quantitation of sulfur amino acids in some sea invertebrates have been allowed using LC-MS tandem.
In order to avoid the derivatization step, Liquid Chromatography (LC) was coupled with an Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) or coupled with Mass Spectrometry (MS). Both detection modes are practically universal but require the development of volatile mobile phases.
Among all the LC systems tried, porous graphitic carbon was chosen and evaluated as stationary phase for underivatized amino acid analysis. Separation of sulfur amino acids (taurine analogous) and partial separations of proteinic amino acids have been obtained using an aqueous volatile mobile phase containing ammonium acetate ajusted to pH=9.3. A complete separation of the 20 underivatized proteinic amino acids was achieved using a mobile phase containing a perfluorinated carboxylic acid (nonafluoropentanoic acid) as volatile ion pairing agent, in a gradient elution mode, at 10°C, in approximatively 40 minutes.
LC systems that have been developed with an ESLD are directly transposable with MS. With the higher specificity of MS or MS tandem detection, the analysis of the 20 underivatized proteinic amino acids is achieved in 20 minutes. While ELSD does not permit detection limits below the mg/l level, MS tandem allows the detection of only about ten µg/l. Thus, direct quantitation of sulfur amino acids in some sea invertebrates have been allowed using LC-MS tandem.
Les acides aminés forment une des plus importantes classes de molécules naturelles. Ils sont impliqués dans de nombreux processus biologiques dont le plus important est sans doute l'élaboration des peptides et protéines. Ils sont pour la plupart dépourvus de groupements chromophores, aussi, la majorité des méthodes chromatographiques proposées pour leur détermination en mélanges implique une dérivation pré- ou post colonne permettant alors une détection spectrophotométrique.
Pour éviter l'étape de dérivation, la Chromatographie en Phase Liquide (CPL) est ici associée au Détecteur Evaporatif à Diffusion de la Lumière (DEDL) ou couplée à la Spectrométrie de Masse (SM). Ces deux modes de détection sont quasi universels mais requièrent la mise au point de phases mobiles volatiles.
Parmi les systèmes CPL testés pour l'analyse directe des acides aminés, le carbone graphitique poreux a été retenu et évalué comme phase stationnaire. Une phase mobile aqueuse saline, volatile, composée d'acétate d'ammonium, ajustée à pH=9,3, permet notamment la séparation d'acides aminés soufrés analogues de la taurine et la séparation partielle d'acides aminés protéiques. En revanche, la séparation totale des 20 acides aminés protéiques est obtenue avec une phase mobile contenant un acide carboxylique perfluoré (acide nonafluoropentanoique) comme agent d'appariement d'ions volatil, en gradient d'élution, à 10°C, en une quarantaine de minutes.
Les systèmes CPL mis au point avec le DEDL sont directement compatibles avec la SM. En utilisant la spécificité de détection de la SM et la SM tandem, l'analyse des acides aminés protéiques est possible en 20 minutes. Si le DEDL ne permet pas de descendre à des concentrations détectées inférieures au mg/l, la SM tandem autorise des limites de détection avoisinant quelques dizaines de µg/l seulement. La CPL-SM tandem a permis le dosage direct d'acides aminés soufrés dans des invertébrés marins.
Pour éviter l'étape de dérivation, la Chromatographie en Phase Liquide (CPL) est ici associée au Détecteur Evaporatif à Diffusion de la Lumière (DEDL) ou couplée à la Spectrométrie de Masse (SM). Ces deux modes de détection sont quasi universels mais requièrent la mise au point de phases mobiles volatiles.
Parmi les systèmes CPL testés pour l'analyse directe des acides aminés, le carbone graphitique poreux a été retenu et évalué comme phase stationnaire. Une phase mobile aqueuse saline, volatile, composée d'acétate d'ammonium, ajustée à pH=9,3, permet notamment la séparation d'acides aminés soufrés analogues de la taurine et la séparation partielle d'acides aminés protéiques. En revanche, la séparation totale des 20 acides aminés protéiques est obtenue avec une phase mobile contenant un acide carboxylique perfluoré (acide nonafluoropentanoique) comme agent d'appariement d'ions volatil, en gradient d'élution, à 10°C, en une quarantaine de minutes.
Les systèmes CPL mis au point avec le DEDL sont directement compatibles avec la SM. En utilisant la spécificité de détection de la SM et la SM tandem, l'analyse des acides aminés protéiques est possible en 20 minutes. Si le DEDL ne permet pas de descendre à des concentrations détectées inférieures au mg/l, la SM tandem autorise des limites de détection avoisinant quelques dizaines de µg/l seulement. La CPL-SM tandem a permis le dosage direct d'acides aminés soufrés dans des invertébrés marins.
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