Structural and functional studies of NOD1
Etudes Structurales et Fonctionnelles de NOD1
Résumé
NOD1 is a cytosolic signaling host pattern-recognition receptor playing a crucial role in innate immunity. It regulates pro-inflammatory pathways by mediating the activation of the nuclear factor NF-kB via its downstream effector RICK following the recognition of a specific bacterial ligand. RICK is recruited by NOD1 through a CARD-CARD interaction. The goal of this thesis was to determine the structural basis of this process. NOD1 CARD was cloned, expressed and purified at the Grenoble EMBL Outstation. Its structure was determined by nuclear magnetic resonance at the IBS in Grenoble. It is generally similar to other CARDs of known structure, consisting of six tightly packed a-helices, although the conformation of some of the inter-helical loops and the orientation and length of the last helix are unusual. Mutations in the CARD domains of both NOD1 and RICK full-length proteins were made in order to define residues important for CARD-CARD interaction. Co-immunoprecipitation of cell lysates and NF-kB activation assays were performed at the University of Michigan Medical School. The results suggest that the interaction is primarily electrostatic and dependent on a patch of three acidic residues on NOD1 CARD (E53, D54, and E56) and three basic residues on RICK CARD (R444, R483 and R488). In addition, two amino acids L44 and I57, located in or close to the acidic patch of NOD1 were found to affect NOD1 signaling. These could be involved in the precise formation of a functional CARD-CARD interaction, or they could interact with other regions of RICK than the CARD domain.
NOD1 est une protéine de surveillance intracellulaire jouant un rôle crucial dans la défense immunitaire innée. Suite à la reconnaissance d'un ligand bactérien spécifique, NOD1 recrute RICK au moyen d'une interaction CARD-CARD. RICK module ensuite l'activation du facteur de transcription NF-kB et initie une cascade de signalisation pro-inflammatoire. Le but de cette thèse était de déterminer la base structurale de ce processus. Le domaine CARD de NOD1 a été cloné, exprimé et purifié à la station EMBL de Grenoble. La structure de ce domaine a été résolue par résonance magnétique nucléaire à l'IBS de Grenoble. Cette structure est généralement similaire à celle des autres domaines CARD connus, étant constituée d'un paquet compact de 6 hélices a. Cependant elle présente des caractéristiques inhabituelles concernant la conformation de certaines boucles inter-hélices ainsi que la longueur et l'orientation de la sixième hélice. Des mutations dans les domaines CARDs des protéines NOD1 et RICK entières ont été réalisées pour identifier les résidus importants pour l'interaction ou la signalisation. Des expériences de co-immunoprécipitations et d'activation de NF-kB ont été effectuées à l'Université du Michigan. Trois résidus d'un patch acide de NOD1 (E53, D54 et E56) et trois résidus d'un patch basique de RICK (R444, R483 et R488) sont indispensables à l'interaction. Celle-ci serait donc de nature électrostatique. Deux autres résidus du patch acide du CARD de NOD1, L44 et I57, ont été identifiés comme importants pour la signalisation. Ces résidus peuvent potentiellement contribuer à la formation d'une interaction CARD-CARD fonctionnelle, ou bien également interagir avec d'autres régions de RICK.