Phosphatase CDC25B: molecular basis od CDC25B intracellular location and search for new interacting partners.
La phosphatase CDC25B: bases moléculaires de sa localisation intracellulaire et recherche de nouveaux partenaires
Résumé
Cellular progression within the cell cycle is governed by a family of protein kinase complexes : the CDK/cyclin complexes. Their activity is regulated, notably by activating dephosphorylation brought about by CDC25 tyrosine-threonine dual specificity phosphatases. Three CDC25 phosphatases have been identified in mammalian cells, and CDC25B has been studied in the course of this work. In human adenocarcinoma (HeLa) cells, we showed that CDC25B is either strictly nuclear or cytoplasmic, or pancellular, suggesting active nucleo-cytoplasmic shuttling. Using site-directed mutagenesis and transient expression of wild-type or mutated proteins, we have identified a nuclear localization signal (NLS) and a nuclear export signal (NES) and showed that cytoplasmic sequestering of CDC25B requires its interaction with 14-3-3 proteins. In order to characterize the mechanisms regulating CDC25B function in vivo, we undertook a search for new interacting partners of this phosphatase. Starting from biochemical observations, e.g. the phosphorylation of CDC25B by Eg3 kinase in vitro, we established, in a cell line expressing conditionally CDC25B, that these proteins interact as well in vivo. A series of CDC25B mutant proteins allowed us to identify (i) the interaction site with protein Eg3, (ii) a phosphorylation site. Phosphorylation by Eg3 did not modify the phosphatase activity of CDC25B. However we showed by flow cytometry analysis that in vivo, CDC25B expression can cancel the piling up of cells in G2 phase caused by overexpression of Eg3. These last results strongly suggest a functional interaction between CDC25B and Eg3, whose mechanisms in vivo will require further studies. The isolation of new protein partners of CDC25B has been undertaken based on co-purification using U2OS cell lines conditionally expressing HA-tagged CDC25B, or recombinant protein MBP-CDC25B. Technical problems have as yet prevented the isolation of partners, but preliminary results are encouraging.
La progression des cellules dans le cycle cellulaire est gouvernée par une famille de complexes à activité protéine kinase : les complexes CDK/cycline. L'activité de ces complexes est régulée notamment par la déphosphorylation activatrice de résidus tyrosine et thréonine par les phosphatases à double spécificité CDC25. Trois phosphatases CDC25 ont été identifiées dans les cellules de mammifères, et lors de notre travail, nous avons étudié la phosphatase CDC25B. Dans les cellules d'adénocarcinome humain (HeLa), nous avons montré que CDC25B présente une localisation nucléaire ou cytoplasmique stricte ou pan cellulaire, suggérant un trafic nucléo-cytoplasmique actif. Par des approches de mutagenèse dirigée et d'expression transitoire de la protéine sauvage ou mutante, nous avons identifié un signal de localisation nucléaire (NLS) et d'export nucléaire (NES) fonctionnels, et montré que la rétention cytoplasmique de CDC25B nécessite son interaction avec les protéines 14-3-3. Afin de caractériser les mécanismes régulant la fonction de CDC25B in vivo, nous avons entrepris la recherche de nouveaux partenaires de cette phosphatase. Partant d'observations biochimiques : la phosphorylation in vitro de CDC25B par la protéine kinase Eg3, nous avons établi que ces deux protéines interagissent in vivo, dans une lignée surexprimant de manière conditionnelle CDC25B. Une collection de protéines mutantes de CDC25B, nous a permis d'identifier (i) le site d'interaction avec la protéine kinase Eg3, (ii) un site de phosphorylation. Aucune modification de l'activité phosphatase de CDC25B, phosphorylée par Eg3 n'est observée in vitro. Cependant, nous avons montré in vivo, par une analyse en cytométrie de flux, que l'expression de CDC25B est capable d'annuler l'accumulation des cellules en phase G2 induite par la surexpression de Eg3. Ces derniers résultats suggèrent fortement une interaction fonctionnelle entre CDC25B et Eg3, dont les mécanismes in vivo restent à préciser. L'isolement de nouveaux partenaires protéiques de CDC25B a été entrepris par leur co-purification grâce à l'utilisation de lignées U2OS exprimant HA-CDC25B de manière conditionnelle, ou de protéines recombinantes MBP-CDC25B. Certains problèmes techniques ne nous ont pas encore permis d'isoler des partenaires, mais les derniers résultats sont prometteurs.