Etude des phases précoces de la transduction des signaux environnementaux chez le lin : une approche protéomique
Résumé
Plants perceive and record environmental stimuli and, since they are unable to move, generally respond to these stimuli by modifying their growth and morphology. A key role in the perception of these stimuli is played by changes in the concentration of free calcium in different intracellular compartments as well as by signal transduction systems that depend on kinases to transmit information to the nucleus where a specific response is generated. In the work presented here, we have studied the effect on flax (Linum usitatissimum L.) or on Arabidopsis thaliana of abiotic stress (mechanical stress, exposure to low temperature, or exposure to non-thermal intensities of electromagnetic radiation at frequencies of 0.9 or 105 GHz). We have used the model of epidermal meristem production in flax to determine the effects of these different stresses in the presence or absence of calcium channel inhibitors or of calcium chelators. We have also developed a proteomic analysis of the flax hypocotyl in which we have formulated a statistical treatment to assess the significance of changes on 2-D gels of proteins. In parallel, we have developed a new method to see if these changes correspond to post-translational modifications by phosphorylation. This method, which is based on secondary ion mass spectrometry, can detect phosphorus in a spot or band after electrophoretic separation on a gel and may therefore be used to detect protein phosphorylation that can be difficult to detect by more traditional techniques. Our proteomic analysis of flax revealed that at least 4 proteins are involved in the rapid response to mechanical stimuli, 7 to a cold shock and 3 to irradiation at 0.9 GHz. 5 proteins were affected by calcium channel inhibitors and by the calcium chelator EGTA whilst 7 proteins were affected by a calcium depletion (which is required for the induction of meristems). Several of these stimuli (from two to four) had the same effect on the same group of 5 of these proteins, consistent with this group playing a fundamental role in signal transduction of abiotic stresses in flax. One of the proteins modified in response to cold shock was identified as saccharopine dehydrogenase. The absence of an appropriate database makes the identification of flax proteins difficult. We therefore resorted to the model plant, Arabidopsis thaliana, where we found 4 proteins affected both by cold shock and by irradiation for 2 h at 0.9 GHz, and 2 other proteins only affected by the irradiation. Two of the proteins affected by both stimuli were identified as carbonic anhydrase and as spermidine synthase. One of the proteins affected only by the irradiation at 0.9 GHz is homologous to the pherophorins. The data we have obtained contribute to our understanding of the initial phases of signal transduction of abiotic stresses in plants. In particular, we have made the unexpected discovery that plants perceive electromagnetic radiation at GHz frequencies and that they probably do this by using abiotic signal transduction pathways.
Les plantes perçoivent et enregistrent les stimuli environnementaux. Du fait de leur immobilité, elles y répondent principalement par des modifications de leur croissance et de leur morphogenèse. La modification transitoire de la concentration du calcium libre dans divers compartiments cellulaires semble avoir un rôle fondamental dans les mécanismes de perception. Les systèmes de transduction des signaux font aussi intervenir des kinases pour véhiculer l'information jusqu'au noyau cellulaire et générer une réponse spécifique. Dans ce travail nous avons étudié l'effet de stimuli abiotiques (stress mécaniques, de froid ou exposition à des micro-ondes de fréquence 0.9 et 105 GHz à une puissance non thermique) chez le lin (Linum usitatissimum L.) et Arabidopsis thaliana. Chez le lin, le modèle de la production de méristèmes épidermiques hypocotylaires nous a permis d'analyser les effets des différents stimuli en l'absence ou en présence d'inhibiteurs de canaux calciques et de chélateur du calcium. En parallèle nous avons développé l'analyse protéomique de l'hypocotyle de lin. Ainsi, nous avons établi un critère statistique permettant d'améliorer la fiabilité de détermination des changements observés sur une carte protéique obtenue par 2-DE. De plus, afin de déterminer si certains changements observés correspondent à des phosphorylations, nous avons mis au point une nouvelle technique d'analyse par spectrométrie de masse d'ions secondaires permettant de détecter directement la présence de phosphore dans un spot après une séparation électrophorétique et qui pourrait permettre la mise en évidence de phosphorylations difficiles à observer par les méthodes conventionnelles. L'analyse protéomique chez le lin a révélé que 4 protéines au moins interviennent dans la réponse rapide aux stimuli mécaniques, 7 à un choc de froid et 3 à une irradiation à 0.9 GHz. Les effets des inhibiteurs de canaux calciques et de l'EGTA portent sur 5 protéines et ceux d'une déplétion calcique (nécessaire pour induire la formation de méristèmes) sur 7. Cependant 5 parmi ces protéines sont affectées de la même façon par deux à quatre de ces stimuli et ont probablement un rôle fondamental dans le traitement des signaux abiotiques chez le lin. Parmi ces protéines une seule impliquée dans la réponse à un choc de froid a été identifiée comme étant la saccharopine déshydrogénase. L'absence de bases de données sur le lin rend difficile l'identification des protéines modifiées par les stimuli. Ainsi en utilisant le modèle Arabidopsis thaliana nous avons mis en évidence des modifications concernant quatre protéines après un choc de froid et outre ces quatre, deux autres après une irradiation de 2 h à 0.9 GHz. Parmi les protéines modifiées par ces deux stimuli, 2 ont été identifiées : l'anhydrase carbonique et la spermidine synthase. De plus l'une des protéines affectées spécifiquement par le rayonnement à 0.9 GHz est une protéine homologue aux phérophorines. Nous avons ainsi apporté des données nouvelles permettant d'avancer dans la compréhension des phases précoces du traitement des signaux abiotiques chez les plantes. En particulier nous avons montré que, de façon inattendue, les plantes perçoivent le rayonnement électromagnétique dans le domaine des GHz en utilisant probablement les voies de transduction des signaux abiotiques.